32P-Postlabeling

Beim ³²P-Postlabeling handelt es sich um eine Methode zum Nachweis von DNA-Addukten.

Einzelschritte

Enzymatische Hydrolyse

Im ersten Schritt erfolgt eine enzymatische Hydrolyse der DNA mittels Nuklease und Phosphodiesterase. Als Produkte entstehen 3'-Monophosphate. Enthielt die DNA DNA-Addukte, so entsteht ein Gemisch aus Addukten und adduktfreien Nukleotiden.

Adduktanreicherung

Die Anreicherung ist fakultativ, erhöht jedoch die Empfindlichkeit. In einem zweiten Schritt spaltet eine selektive P1-Nuklease das 3'-Phosphat von den normalen Nukleotiden ab. Die durch Addukte modifizierten Nukleotide sind abbauresistent, so dass es zu einer Anreicherung kommt.

Alternativ ist es auch möglich, mittels n-Butanol-Extraktion die Addukte mit hydrophober Struktur zu extrahieren und somit anzureichern.

Phosphorylierung

Zur Markierung der Nukleotide wird durch T4-Polynukleotid-Kinase ein radioaktiver Phosphatrest von [γ-³²P]-ATP auf die Nukleotide im Ansatz übertragen. Es entstehen Desoxyribonukleosid-3'-[5'-³²P]-bisphosphate.

Trennung und Nachweis

Mittels mehrdimensionaler Dünnschichtchromatographie und Szintillation bzw. mittels HPLC kann nun der Nachweis erfolgen. Die Nachweisgrenze liegt bei 1 Addukt auf 10¹⁰ N.

Literatur

• Ramesh C. Gupta: Enhanced Sensitivity of 32P-Postlabeling Analysis of Aromatic Carcinogen: DNA Adducts. in: CANCER RESEARCH, 45, 5656-5662, November 1985, (PDF).
• M. V. Reddy und K. Randerath: Nuclease P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. in: Carcinogenesis 7(1986) 1543-1551. PMID 3017601
• D. H. Phillips: Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. in: Mut. Res., 378(1997) 1-12. PMID 9288880
• K. Randerath und E. Randerath: P-32 postlabeling methods for DNA adduct detection - overview and critical-evaluation. in: Drug Metab. Rev., 26(1994) 67-85. PMID 8082582
• K. Randerath, M. V. Reddy und R. C. Gupta: 32P-labelling test for DNA damage. in: PNAS, 78(1981) 6126-6129. PMID 7031643
• A. Weston: Physical methods for the detection of carcinogen-DNA adducts in humans. in: Mut. Res., 288(1993) 19-29. PMID 7686262
• A. Weston und M. C. Poirier in H. A. Milman und E. K. Weisburger (Editors) „Handbook of Carcinogen Testing“