Shuttle Plasmid

In der Gentechnik und der Biotechnologie versteht man unter einem Vektor ein Transportvehikel ("Genfähre") zur Übertragung einer Fremd-Nukleinsäure (oft DNA) in eine lebende Empfängerzelle. Als Vektoren werden verschiedene solcher Vehikel bezeichnet:

• Plasmide, die beispielsweise das Klonieren eines bestimmten DNA-Abschnittes ermöglichen,
• Cosmide oder YACs, die mit Hilfe von Bakteriophagen- bzw. Hefezellstrukturen große DNA-Abschnitte transferieren können,
• und modifizierte Viren (z. B. Adenoviren oder Retroviren), die auch als virale Vektoren bezeichnet werden.

Eignung eines Vektors

Verschiedene Vektoren können gemäß den gegebenen Rahmenbedingungen eine unterschiedliche Eignung als Transportvehikel aufweisen. Der Vektor sollte sich möglichst einfach in die Empfängerzelle einschleusen lassen (hierbei spielt unter anderem die spezifische Immunabwehr eine Rolle) und er sollte sich unabhängig von deren Hauptgenom replizieren können, um eine starke Vermehrung zu gewährleisten.

Vektor	max. Kapazität (kbp)	Grund
Plasmid	10-15 kbp	sonst keine Ringbildung
M13-Phage	< 6 kbp	sonst keine Verpackung
Phagemid	< 6 kbp	sonst keine Verpackung
λ-Phage	< 25 kbp	sonst keine Verpackung
Cosmid	< 50 kbp	sonst keine Verpackung
P1-Phage	30-100 kbp	?
BAC	100-300 kbp	?
PAC	100-300 kbp	?
YAC	20-2000 kbp	Instabilität bei Mitose und Meiose

Vektortypen

Vektoren werden nach den Lebewesen, die sie in sich tragen, in verschiedene Typen eingeteilt. Jeder Typ hat bestimmte Eigenschaften und sagt dadurch einiges über die Eignung des Vektors aus.

Plasmidvektoren

Plasmidvektoren sind Vektoren, die aus Plasmiden gewonnen werden. Häufig tragen Prokaryoten Plasmide, jedoch auch einige Eukaryoten (Hefezellen). Die am meisten verwendete Wirtszelle für Plasmidvektoren ist das Bakterium Escherichia coli. Dieses Bakterium zählt wohl zu den am häufigsten verwendeten Lebewesen in der Gentechnik.

Die Vorteile von Plasmidvektoren sind klar: Sie sind einfach zu verwenden, da sie klein sind und leicht aus der Zelle gewonnen werden können. Außerdem sind Plasmide für das Überleben der Zelle nicht unbedingt notwendig. Ein Eingriff hat daher selten Auswirkungen auf die Wirtszelle. Darüberhinaus werden Plasmide unabhängig vom Bakterienchromosom repliziert und können daher in den Zellen in vielen Kopien vorliegen. Dabei ist die Kopienzahl abhängig von der Art des Plasmids und dessen Replikationsstartpunkt (origin of replication).

Um Plasmidvektoren verwenden zu können, müssen die natürlich vorkommenden Plasmide erheblich verändert werden. Aus der riesigen Anzahl kann man sich ein geeignetes Molekül aussuchen. Besonders beliebt sind Resistenzplasmide, da sie sehr leicht mit einem Antibiotikum selektiert werden können. Zudem sollten die Vektormoleküle eine Multiple Cloning Site (MCS) enthalten. Dabei handelt es sich um einen DNA-Abschnitt, der in kurzen Abständen eine Vielzahl von Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen vom Typ II enthält, die jeweils nur ein einziges Mal im Vektormolekül vorhanden sein dürfen. Idealerweise befindet sich die MCS in einem weiteren Markergen für die Doppelselektion, dessen Funktion durch die Integration der Fremd-DNA zerstört wird. Daher exprimieren nur diejenigen Zellen die Produkte des Markergens, welche die Fremd-DNA nicht enthalten und können daher von den Zellen unterschieden werden, die die Fremd-DNA im Vektormolekül integriert enthalten. Damit die in den Vektor integrierte Fremd-DNA in der Wirtszelle vermehrt werden kann muss der Plasmidvektor auch einen Replikationsstartpunkt besitzen.

Der Hauptnachteil von Plasmidvektoren besteht in ihrer geringen Kapazität: Schon bei einem DNA-Fragment von 5 kb Länge nimmt die Effektivität der Klonierung ab. Die maximal mögliche Länge liegt bei 10–15 kb. Da in vielen Fällen längere Sequenzen kloniert werden, ist man auf andere Vektoren angewiesen.

Eine Plasmidvektor-Variante sind die Shuttle-Plasmide, auch Shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren genannt, die sowohl in Bakterien als auch in einem Zielorganismus abgelesen und vermehrt werden kann.

Normalerweise wird DNA, die entsprechende Erbinformation enthält, in einen Zielorganismus eingebracht (s. auch Transformation). Häufig kommt es in der Praxis aber vor, dass der Zielorganismus nicht leicht zu verändern ist, weil er DNA nur schlecht aufnimmt und nicht vermehrt. Dadurch würde unter den gesamten Zellen nur ein kleiner, nicht signifikanter Teil verändert und die Gesamtkultur wäre als Studienobjekt unbrauchbar. Die vorherige Vermehrung der DNA in Bakterien erlaubt den Einsatz größerer Mengen DNA und damit die Veränderung eines größeren Anteils von Zielzellen. Der Shuttle-Vektor bietet dabei den Vorteil, direkt in beiden Organismen eingesetzt werden zu können.

In Shuttle-Plasmiden ist die DNA in Plasmidform mit zwei Replikationsstartpunkten für zwei unterschiedliche Organismen ausgestattet. Häufig setzt man Shuttle-Plasmide mit einem pro- und einen eukaryontischen Replikationsursprung ein. Somit kann die Replikation des Plasmids in Prokaryonten (Bakterien) und Eukaryonten (Pflanzen, Pilze, Tiere) stattfinden.

Shuttle-Plasmide werden insbesondere eingesetzt, wenn eine bestimmte Spezies (zum Beispiel Hefen) nur geringe Mengen an zirkulärer DNA liefert, aber z.B. für Untersuchungen größere Mengen gebraucht werden. Die Plasmide werden daher in der Regel im Bakterium Escherichia coli amplifiziert. Hierzu müssen die Plasmide neben den Elementen ihres Herkunftsorganismus (hier also Hefe) Sequenzen zur autonomen Replikation und Selektion in ihrem Wirtsorganismus (hier also E. coli) besitzen. Man bezeichnet solche Plasmide dann als Shuttle-Plasmid (engl: shuttle = Pendelverkehr). Das Plasmid kann also zwischen zwei verschiedenen Organismen pendeln.
Des weiteren sind eine oder mehrere Restriktionsschnittstellen erforderlich, die das Klonieren von Fremd-DNA ermöglichen und günstigerweise nur einmal auf dem Vektor vorhanden sind.

Über die Amplifikation der interessierenden DNA in der Bakterienkultur erhält man auf einfache und schnelle Weise ausreichend große Mengen an DNA, die dann zur Untersuchung und Manipulation des eigentlichen, in der Regel eukaryotischen Zielorganismus eingesetzt werden kann.

Virale Vektoren

Als Virale Vektoren werden modifizierte Viren bezeichnet, die eukaryotische Zellen transduzieren und dabei fremde Gene in diese Zellen einschleusen können. Sie werden beispielsweise in der Gentherapie eingesetzt.

Bakteriophagenvektoren

Bakteriophagen (kurz: „Phagen“) sind Viren, welche Bakterien befallen. Sie werden nach ihrer Wirtszelle in verschiedene Gruppen eingeteilt.

Die Verwendung von Bakteriophagenvektoren beruht auf dem lysogenen Zyklus der Phagen. Viren lassen sich in virulente und temperente einteilen. Virulente Viren haben einen lytischen Zyklus, das heißt sie dringen in ihre Wirtszelle ein und veranlassen diese zur Bildung neuer Viren. Temperente Viren haben einen lysogenen Zyklus, sie bauen ihr Genom in das der Wirtszelle ein.

Darin liegt das Interesse der Forscher. Durch den Einbau des Virusgenoms kann auch ein zu untersuchendes DNA-Fragment in die Zelle eingeschleust werden.

Cosmide

Durch die Überschneidung von Plasmiden mit den kohäsiven Enden der Bakteriophagen-DNA erhält man so genannte Cosmide.

Man verwendet dazu den Bakteriophagen Lambda. Dessen Genom hat kurze einzelsträngige Enden, die zueinander komplementär sind und sich so zu einem Ring schließen können. Diese Enden werden als cos-Region (engl. cohesive sites: kohäsive Enden) bezeichnet.

Der große Vorteil von Cosmiden im Gegensatz zu Plasmidvektoren besteht darin, dass sie selbst wesentlich kürzer sind und daher eine größere Aufnahmekapazität besitzen. Cosmide können Abschnitte bis etwa 47 kb Länge aufnehmen und übertreffen dadurch sogar Phagenvektoren.

Verarbeitet werden Cosmide wie Bakteriophagenvektoren. Da sie jedoch keine Phagengene enthalten, verhalten sie sich in der Wirtszelle wie Plasmide. Dies macht sie zu sehr attraktiven Vektoren. Jedoch sind Cosmide schwer zu handhaben, wodurch die Vorteile wieder ausgeglichen werden.

Phasmide

Phasmide funktionieren ähnlich wie Cosmide, sind also ebenfalls Hybridvektoren aus Plasmid und Phage, jedoch bleibt dabei die Plasmidfunktion bestehen und wird exprimiert.

Literatur

• D.S.T. Nicholl: Gentechnische Methoden (ISBN 3-86025-298-4; 178 Seiten) Einführung in allgemeine gentechnische Bereiche.

Siehe auch

• RMCE-Kassettenaustauschverfahren