FLP-FRT Recombination

Das Cre/loxP-System ist ein in den 1980er Jahren entwickeltes und von DuPont patentiertes Rekombinations-System. Es ermöglicht das gezielte Entfernen von DNA-Sequenzen in lebenden Organismen. Mit dieser Technik können beispielsweise einzelne spezifische Zell- oder Gewebearten genetisch modifiziert werden, während andere Gewebe davon unberührt bleiben. Ursprünglich stammt dieses System aus dem Bakteriophagen P1 und findet heute v.a. in der molekularbiologischen Forschung und zur Herstellung gentechnisch veränderter Pflanzen Anwendung. Ein analoges System, das jedoch weniger häufig verwendet wird, ist das Flp-FRT-System.

Funktionsweise

Je nach Orientierung der loxP-Sequenz katalysiert Cre die Exzision oder Inversion

Cre (causes recombination) bzw. Flp (benannt nach der Flippase-Aktivität, durch die Hefen Sequenzabschnitte invertieren) sind Enzyme der Klasse der Rekombinasen. Diese Proteine, die natürlicherweise in allen Organismen vorkommen, katalysieren die Spaltung und Neuverknüpfung von DNA zwischen spezifischen Basensequenz. Diese Erkennungssequenz wird als loxP bzw. FRT bezeichnet.

Soll aus einem DNA-Strang eine bestimmte DNA-Sequenz bzw. ein bestimmtes Gen entfernt werden, setzt man gezielt vor und hinter diesen DNA-Abschnitt eine loxP-Stelle, was als floxen bezeichnet wird. Das Cre-Enzym erkennt und bindet die jeweiligen loxP-Stellen. Dabei schneidet sie die entsprechende DNA-Sequenz bzw. das Gen heraus, wenn die beiden loxP-Sequenzen in gleicher Richtung orientiert sind (Exzision). Die beiden verbleibenden loxP-Enden werden zusammengefügt, der entstehende kurze ringförmige DNA-Abschnitt wird in der Zelle abgebaut. Sind die beiden loxP-Sequenzen auf der DNA in entgegengesetzter Richtung orientiert, katalysiert das Enzym die Inversion (d.h. das Vertauschen der beiden Enden) des gefloxten Abschnittes, der um 180° gedreht im DNA-Strang verbleibt.

Anwendungsbereiche

Pflanzen

Das Cre/loxP-System wird beispielsweise dazu verwendet, gezielt Markergene aus transgenen Pflanzen zu eliminieren. So ist es möglich, transgene Organismen zu erzeugen, ohne dass anschließend eine Selektion auf Grundlage von Herbizid- oder Antibiotikaresistenzen notwendig wird. Hierzu muss zunächst Cre-Rekombinase vorübergehend (transient) in die Zelle übertragen werden. Diese Übertragung kann sowohl mit Hilfe eines Pflanzenvirus (PVX, TMV) als auch durch Agrobacterium tumefaciens erfolgen. Die durch die Rekombinase Cre ausgelösten Rekombinationsereignisse können auf die nächste Generation über Regeneration oder Selbstbestäubung übertragen werden. Die Nachkommen aus der Selbstbestäubung sind dann, wenn alle Reaktionsschritte erfolgreich verlaufen sind, markerfrei, tragen aber das interessierende Gen.

Tiere

Ein Modellversuch, der sich des Cre / LoxP Systems bedient

Das System funktioniert auch in Säugetierzellen zuverlässig und ohne weitere Kofaktoren. Mittlerweile ist es zur Herstellung gewebsspezifischer Knockout-Mäuse weit verbreitet. In welchem Gewebe und zu welchem Zeitpunkt in einem Lebewesen ein Gen angeschaltet wird, hängt hauptsächlich von dem zugehörigen Promotor ab. Promotor und Cre werden zusammen als Transgen in das Mausgenom eingebracht. Sollen z.B. Gene nur im Gehirn ausschalten, sucht man sich ein Protein, das nur dort vorkommt und setzt den zugehörigen Promotor vor das Cre-Gen, wodurch Cre-Rekombinase nur im Gehirn gebildet wird.

Nun wird noch eine zweite Mauslinie benötigt, bei der das Gen, das ausgeschaltet werden soll, gefloxt ist. Werden die beiden Mäuse nun verpaart, erhält man unter anderem Nachkommen, die beide genetische Veränderungen in ihrem Erbgut tragen. Ein Protein, das in jeder Körperzelle vorkommt, wird so beispielsweise nur im Gehirn nicht mehr gebildet, da das Gen dort durch die Rekombinase unbrauchbar gemacht wird.

Ein Nachteil hierbei ist, dass die meisten Promotoren schon bald in der Embryonalentwicklung aktiviert werden. Wird ein wichtiges Gen schon früh ausgeschaltet, sind die Tiere oft nicht lebensfähig und können nicht untersucht werden. Um dieses Problem zu umgehen, wurden Methoden erfunden, dass Cre zu einem beliebigen Zeitpunkt angeschaltet werden kann. Dies gelingt z.B. mit Liganden-aktivierbaren Cre-Rekombinasen. Cre wurde dabei mit der modifizierten Ligandenbindungsdomäne (LBD) von Estrogenrezeptoren fusioniert, die nicht mehr an körpereigenes Estrogen binden, dafür aber an synthetisches Tamoxifen, einem Antiestrogen. Diese Rezeptoren funktionieren so, dass sie sich im Zytoplasma befinden und erst nach Bindung des Liganden in den Zellkern überführt werden, wo sich die DNA befindet. Somit verbleibt auch Cre im Zytoplasma, bis den Tieren Tamoxifen verabreicht wird. Sobald dieses an den modifizierten Rezeptor bindet, wird er zusammen mit Cre in den Zellkern gebracht, wo Cre dann die gefloxten Gene ausschneiden kann.

Siehe auch

• Rekombinase

Quellen

• Metzger, D., & Chambon, P. (2001). Site- and time-specific gene targeting in the mouse. Methods, 24(1), 71-80.
• Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., & Chambon, P. (1997). Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochem Biophys Res Commun, 237(3), 752-757.

Weblinks

• Cre-loxP vermittelte konditionale Mutagenese des cGMP-Signalwegs in der Maus