Hämalaun

Strukturformel von Hämatoxylin

Hämatoxylin ist ein Inhaltsstoff des Blauholz (Haematoxylon campechianum) und verwandter Arten. Er wird insbesondere in der Histologie zum Färben Zell- und Gewebestrukturen, wie z. B. Zellkernen, Mitochondrien, Myelin, Elastin und Kollagenfasern eingesetzt. Darüber hinaus fand es in der Färberei und in der Tintenproduktion Anwendung.

Gewinnung

Hämatoxylin wird durch Extraktion aus dem Kernholz vom Haematoxylon-Arten gewonnen. Dazu wird primär ein wässriger Extrakt hergestellt, der nach einer Extraktion mit Ether eingeengt wird. Alternativ kann Hämatoxylin auch aus dem wässrigen Extrakt durch Fällung mit Harnstoff gewonnen werden. Eine synthetische Herstellung von Hämatoxylin ist ebenso beschrieben.

Chemie

Hämatein, ein aus Hämatoxylin durch Oxidation gebildeter Farbstoff

In seiner reinen Form ist Hämatoxylin farblos bis beige. Durch Oxidation mittels Luftsauerstoff (langsam) oder einem geeigneten Oxidationsmittel (z. B. Natriumiodat, Kaliumpermanganat, Wasserstoffperoxid oder Iod) entsteht in wässriger oder alkoholischer Lösung aus Hämatoxylin das ockerbraun gefärbte Hämatein. Diesen Vorgang nennt man auch Reifung (natürlich bzw. künstlich). Hämatein ist ein leicht saurer Farbstoff. Die gewünschte färbende Wirkung wird erst durch den Zusatz mehrwertiger Metall-Kationen als Beize erreicht. In Gegenwart mehrwertiger Kationen, wie z. B. Eisen (Fe³⁺) und Aluminium (Al³⁺) bilden sich Farbstoffkomplexe durch Chelatbildung in der Stöchiometrie 1:1. Komplexe aus Hämatein und Alaunen werden dabei als Hämalaune bezeichnet. Hämalaune zeigen die typische dunkelblau-violette Farbe und werden auch als Hämatoxylinlack (eigentlich Hämateinlack) bezeichnet. Für die Herstellung von hämatoxylinhältigen Farblösungen gibt es über 100 verschiedene Rezepte. Weit verbreitet ist die Verwendung von Hämatoxylin nach Mayer, Harris, Gill (Hämalaune) und Weigert (Eisenhämatoxylin). Diese Farblösungen enthalten den basischen Farblack in saurem Milieu (pH 3–4). Die Anbindung des Farblacks an das Substrat erfolgt wiederum durch Chelatbildung an mehrwertige Kationen mit anionischen Strukturen (z. B. Phosphatgruppen der Nukleinsäuren des Zellkerns). Diese Kombination aus kovalenter und koordinativer Bindung ist stabil genug um nachfolgende Spülschritte in Wasser und Alkohol zu überstehen. Bei dem niedrigen pH-Wert der Färbelösung erscheinen die gefärbten Strukturen rötlich-braun, erst durch Anheben des pH-Wertes durch Spülen in Leitungswasser (pH 6,8–7,0) entsteht die typische blau-violette Färbung.

Durch Variation des pH-Wertes kann eine Selektivität für verschiedene Strukturen erreicht werden. Während bei einem pH-Wert von > 4,5 zahlreiche Zellstrukturen gefärbt werden, dominiert bei einem pH-Wert von 2–3 die Anfärbung von Zellkernen.

Histologie

Hämatoxylin-Eosin-Färbung von Krebszellen

In der Histologie wird Hämatoxylin zum Färben von Zell- und Gewebestrukturen, wie z. B. Zellkernen, Mitochondrien, Myelin, Elastin und Kollagenfasern eingesetzt. Zahlreiche Varianten der Hämatoxylinfarblösungen wurden entwickelt, die sich insbesondere in der Hämatoxylinkonzentration, der Wahl des Oxidationsmittels sowie der Wahl des Kations (Beize) und somit im Färbeverhalten unterscheiden. Beispiele hierfür sind die Farblösungen nach Harris, Ehrlich, Mayer, Weigert, Heidenhain und Verhoeff.

In Kombination mit der Hämatoxylin-Färbung (Zellkernfärbung) wird in der Regel eine Gegenfärbung mit einem kontrastreichen Zytoplasmafarbstoff durchgeführt. Klassisch wird eine Gegenfärbung mit Eosin durchgeführt (Hämatoxylin-Eosin-Färbung), bei der kationische/eosinophile Strukturen (z. B. Proteine) angefärbt werden. Hierbei werden Zellkerne üblicherweise dunkelblau eingefärbt, während die anderen Zellbestandteile hellrosa bis pink erscheinen. Für die HE-Färbung werden Hämalaune eingesetzt. Bei Bindegewebsfärbungen (z. B. Van-Gieson, Masson-Trichrom) findet man üblicherweise die Eisenhämatoxylinlösung nach Weigert in Kombination mit anderen sauren Farbstoffen (z. B. Pikrofuchsin, Anilinblau, Orange G, Säurefuchsin, u.v.m.). Bei der Immunohistochemie wird eine Kernfärbung mit Hämalaun als Gegenfärbung angeschlossen. Das Färbeergebnis zeigt hier positive Reaktionen in rötlich-braun (DAB) mit zart-blauen Kernen.

Geschichte

Die bereits zuvor in Amerika genutzten Blauholzextrakte wurden erstmals durch den spanischen Konquistador Hernán Cortés im Jahre 1520 nach Europa gebracht. Seine erste schriftliche Erwähnung als Farbstoff ging auf Robert Hooke im Jahr 1665 zurück. Quekett (1848) und Waldeyer (1863) führten diesen Farbstoff in die Histochemie ein. Die Resultate waren jedoch nicht befriedigend, da beide diesen Farbstoff direkt einsetzten. Die heute noch verwendete kombinierte Anwendung von Hämatoxylin und einem Metallsalz geht auf Böhmer (1865) zurück.

Weblinks

• Haematoxylin and Counterstains – Anthony E. Woods (en)
• Histologieprotokolle einschl. Hämatoxylinfärbungen auf IHCWorld.com (en)
• Alles über biologische Färbungen; Stainsfile