Expressionsanalyse

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Die Genexpressionsanalyse bezeichnet eine Untersuchung der Umsetzung der genetischen Information (Genexpression) mit molekularbiologischen und biochemischen Methoden. Sie kann für einzelne Gene als auch für ganze Genome angewendet werden und ermöglicht qualitative und quantitative Aussagen über die Aktivität verschiedener Gene. Während im ersten Fall nur die Sequenzinformation des zu untersuchenden Genes bekannt sein muss, wird für die Genom-weite Analyse die gesamte Sequenzinformation des Genoms gebraucht.

Qualitätive Analyse:

• Wird ein Gen unter den untersuchten Umständen überhaupt exprimiert?
• In welchen Zellen findet eine Expression statt (beispielsweise in situ Hybridisierung)?

Quantitative Anaylse:

• Wie stark ist der Expressionsunterschied gegenüber einer definierten Referenz?
  • gesunde vs. kranke Zellen
  • Wildtyp vs. Mutantenzellen
  • unstimulierte vs. stimulierte Zellen

Je nach Methode werden die Produkte der verschiedenen Ebenen der Genexpression analysiert:

• Ribonukleinsäure (RNA) bzw. cDNA
• Proteine

Methoden

• Mit der in-situ-Hybridisierung wird sequenzspezifisch RNA eines definierten Gens/Gen-Sets im Gewebe detektiert und das lokale Genespressionmuster bestimmt.

• Bei der Northern-Blot-Methode wird RNA zunächst isoliert und elektrophoretisch nach ihrer Größe in einem Gel aufgetrennt. Nach Übertragung auf eine Membran Blotting wird die gesuchte RNA-Sequenz durch markierte Sonden (Radioisotope, Fluoreszenz-Farbstoffe) aus komplementärer RNA oder DNA über komplementäre Bindung nachgewiesen. In der Regel werden nur geringe Anzahlen von Sequenzen simultan untersucht.

• In DNA-Microarrays oder -Makroarrays kann die Menge an messenger-RNA (mRNA) einer Vielzahl von Genen aus Zellen einer Kultur/eines Gewebes simultan bestimmt werden. Dazu wird die mRNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Die Detektion erfolgt bei dieser Methode über komplementäre Hybridisierung der markierten cDNA (Radioisotope, Fluoreszenzfarbstoffe) mit den Sonden des DNA-Arrays.

• Mit der Seriellen Analyse der Genexpression“ (SAGE) und insbesondere SuperSAGE kann die Expression theoretisch aller Gene sehr genau bestimmt werden, indem von jedem Transkript ein kurzes Stück (dem sog. "Tag" = engl. Etikett) erzeugt wird, und möglichst viele dieser Tags sequenziert werden. Vorteil gegenüber Microarrays ist die sehr viel bessere Quantifizierung der Transkripte, sowie die Möglichkeit (v.a. mit SuperSAGE) neue Transkripte zu identifizieren und Organismen mit unbekannten Genomen zu untersuchen.

• Die Real time quantitative PCR ist eine Variante der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Durch dem Reaktionsgemisch zugesetzte Farbstoffe oder spezielle Sonden wird die Konzentration des Produktes während der PCR verfolgt. Die zeitliche Änderung der Konzentration ermöglicht Rückschlüsse auf die Ausgangskonzentration der betreffenden Nukleinsäure.

• Mit der Western-Blot-Methode werden Proteine hinsichtlich verschiedener Eigenschaften wie Größe, elektrischer Ladung oder Isoelektrischem Punkt aufgetrennt und anschließend mit Antikörpern nachgewiesen. In der Regel wird nur eine überschaubare Anzahl von Genprodukten simultan untersucht.

• Durch die differenzielle Analyse von 2D-Gelen kann die Expression von bis zu 10000 Proteinen gliechzeitig durchgeführt werden. Dazu werden die Proteinextrakte aus Zellkulturen/Geweben gewonnen, zweidimensional nach pI (isoelektrischer Punkt) und MW (molare Masse) aufgetrennt und mittels Markierung bzw. diverser (Fluoreszenz)färbungstechniken detektiert und quantifiziert. Die ermittelten Intensitäten verschiedener Proben werden miteinander verglichen und somit das Expressionsverhalten über verschiedene Bedingungen verfolgt.

• In Protein-Arrays wird, analog zu DNA-Arrays, die Menge bestimmter Proteine untersucht. Zur Detektion nutzt man die zahlreichen Interaktionen von Proteinen mit anderen Molekülen aus: z. B. Enzym-Substrat-, Antikörper-Antigen- oder Rezeptor-Botenstoff-Interaktion.

• In den letzten Jahren gewinnt die massenspektrometrische Anaylse von Proteingemischen immer weiter an Bedeutung. Über die "spectral abundance" werden Proteinstücke Peptide, ähnlich wie bei SAGE die DNA-Fragmente vorhandener RNAs, gezählt und somit deren Häufigkeit quantifiziert. Andere Methoden nutzen die Signalintensität bestimmter Peptide im Massenspektrum als Maß für die Häufigkeit.

Viele Methoden bedienen sich Fluoreszenzfarbstoffen, die an die Sonden (RNA-Sonden, Antikörper etc.) gekoppelt sind und mittels Fluoreszenzspektroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Letztere bietet den Vorteil einer hohen räumlichen Auflösung. Daneben werden auch radioaktiv markierte Sonden eingesetzt, oder solche, die durch gekoppelte Enzyme Chromogene in Farbstoffe umwandeln.