Fluoreszenzdetektor

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid chromatography, HPLC) - in den Anfangszeiten dieser Technik auch Hochdruckflüssigchromatographie (engl. high pressure liquid chromatography) genannt - ist eine analytische Methode in der Chemie. Die HPLC ist ein Flüssigchromatographie-Verfahren, mit dem man nicht nur Substanzen trennt, sondern diese auch über Standards identifizieren und quantifizieren (die genaue Konzentration bestimmen) kann. Im Unterschied zur Gaschromatographie, die eine sehr gute Trennmethode für verdampfbare Stoffe ist, können mittels HPLC auch nicht flüchtige Substanzen analysiert werden.

Funktionsweise

Es handelt sich um ein chromatographisches Trennverfahren, bei dem die zu untersuchende Substanz zusammen mit einem Laufmittel, der mobilen Phase (auch „Elutionsmittel“ oder „Eluent“ genannt) durch eine sogenannte Trennsäule, welche die stationäre Phase enthält, gepumpt wird. Eine Trennsäule in einem HPLC-Gerät ist zwischen 1,8 und 30 cm lang und hat zumeist einen Innendurchmesser von 2-4,6 mm im Falle von analytischen HPLC-Systemen. Das Trennvermögen einer HPLC-Chromatographie ist etwa 100 mal größer als in der Säulenchromatographie. Gelegentlich wird eine sogenannte Vorsäule aus wirtschaftlichen Gründen vorgeschaltet; dabei handelt es sich um eine kurze Säule, die Verunreinigungen von der Hauptsäule abhalten soll. Die HPLC findet auch Verwendung für die Reinigung von Substanzen als (semi-)präparative HPLC. Die Innendurchmesser können erheblich größer sein, da bis hin zum Produktionsmaßstab eine Aufreinigung durchgeführt werden kann.

HPLC-Apparatur

Der auf die wesentlichen Elemente reduzierte Aufbau einer typischen HPLC-Apparatur kann der nebenstehenden Abbildung entnommen werden.

Wechselwirkt ein Bestandteil der zu untersuchenden Substanz stark mit der stationären Phase, verbleibt er relativ lange in der Säule. Wechselwirkt er hingegen schwach mit der stationären Phase, verlässt er die Säule früher. Je nach Stärke dieser Wechselwirkungen erscheinen die Bestandteile der Substanz zu verschiedenen Zeiten (den Retentionszeiten) am Ende der Trennsäule, wo sie dann mit einem geeigneten Detektor nachgewiesen werden können.Für die Umkehrphase ist die Retentionszeit einer Substanz abhängig von der Verweildauer in der stationären Phase (Lösungsmittelfilm um die Alkylketten des modifizierten Kieselgels). Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist die Zurücklösung in die mobile Phase.

Es werden zwei Methoden unterschieden: Normalphase (NP) und Umkehrphase (engl. reversed phase, RP). Bei der NP-HPLC wird eine polare stationäre Phase (z. B. Silicagel/Kieselgel) genutzt. Die Stärke der Elutionskraft der mobilen Phase ist im allgemeinen abhängig von der Polarität. Die verschiedenen Lösungsmittel sind nach steigender Polarität in der elutropen Reihe angeordnet. Je polarer eine mobile Phase ist, desto schneller wird eine Substanz eluiert. Polare Moleküle werden auf der Säule länger retardiert (zurückgehalten) als unpolare Moleküle und verlassen deshalb die Säule später.

Die RP-HPLC ist in der Praxis die gängigste Methode. 70 % aller analytischen HPLC-Trennungen sind RP-Trennungen. Hier wird eine unpolare stationäre Phase verwendet, und die Elutionskraft sinkt mit steigender Polarität. Die stationäre Phase wird hergestellt, indem man Silane, welche mit langkettigen Kohlenwasserstoffen substituiert wurden, mit Silicagel reagieren lässt. Dabei wird die polare Oberfläche der Silicagel-Partikel mit einer unpolaren Schicht aus Alkanen überzogen, also die Polarität umgekehrt. Als mobile Phase werden meist Mischungen aus Wasser oder Puffer und Acetonitril oder Methanol eingesetzt. Bei isokratischen Trennungen bleibt die Zusammensetzung der mobilen Phase während der gesamten Zeit gleich. Bei Gradiententrennungen wird die Polarität des Fließmittelgemisches während der Analyse verändert. Besondere Anwendung findet die RP-HPLC bei der Auftrennung von polaren Analyten, die auf Normalphasen zu hohe Retentionszeiten aufweisen würden. Dafür wird meist eine C18-Säule (also ein Octadecylsilan als Derivatisierungsreagens für das Silicagel, daher auch die häufige Bezeichnung ODS-Säule^[1]) eingesetzt, die Detektion erfolgt zumeist mittels UV- oder Fluoreszenzdetektor.

Praktische Durchführung und Anwendungen

Eine chemische Verbindung kann man mittels HPLC nur bedingt identifizieren, indem man die Retentionszeit der unbekannten Substanz mit der eines Standards (einer bekannten Substanz) vergleicht (externe Standardisierung). Ist die Retentionszeit gleich, kann man der Probe mit der unbekannten Substanz auch etwas Standard zusetzen und untersuchen, ob beim Chromatogramm nach wie vor nur eine Spitze („Peak“) sichtbar ist, ob ein „Doppel-Peak“ entstanden ist oder ob am Chromatogramm zwei getrennte „Peaks“ mit sehr ähnlicher Retentionszeit sichtbar werden (interne Standardisierung). Wenn nach Zusatz von Standard zur Probe nur eine Spitze sichtbar ist, kann man allerdings noch nicht davon ausgehen, dass die chemische Verbindung in der Probe und im Standard identisch ist. Ein weiterer Parameter wäre der Abgleich des UV-Spektrums bei Verwendung eines Diodenarray-Detektors oder der Massenspur bei einem gekoppelten Massenspektrometer. Alternativ führt man dieses Experiment unter zwei unterschiedlichen Trennbedingungen (z. B. HPLC Trennungen mit zwei unterschiedlichen Säulen) durch; so kann man damit unbekannte chemische Verbindungen mit einer gewissen Sicherheit identifizieren.

Will man die Konzentration einer chemischen Substanz bestimmen (z. B. von Vitamin E in einem pflanzlichen Öl), so kann man dies durchführen, indem man Standards dieser chemischen Substanz mit bekannten Konzentrationen herstellt und die Peak-Fläche der Standards mit den Peak-Flächen der Substanz in den Proben vergleicht. Es ist darauf zu achten, dass bei einer vorangehenden Probenaufarbeitung die Wiederfindungsrate mit in die Berechnung der Konzentration einbezogen wird.

HPLC wird nicht ausschließlich zu analytischen Zwecken eingesetzt, sondern auch in der chemischen Industrie, um ein Produkt (z. B. Proteine) von Verunreinigungen zu trennen. Hierbei kommen Säulen mit bis zu einem Meter Durchmesser zum Einsatz.

Trennung von Tryptophan und Oxidationsprodukten

Methodenentwicklung

Die Trennung der Substanzen ist von vielen Parametern abhängig, darunter

• Art und Maße der Trennsäule,
• Zusammensetzung der mobilen Phase,
• Temperatur,
• pH-Wert und
• Laufzeit.

Zum Erreichen einer vollständigen und reproduzierbaren Trennung muss meist für jedes komplexere Stoffgemisch, gerade bei der Gradientenmethode, eine eigene Methode entwickelt werden. Schon geringe Abweichungen von einer Methode können eine Änderung der Selektivität bedeuten. Ziel einer Methodenentwicklung ist ein Chromatogramm, bei dem alle Spitzen vollständig getrennt sind, jedoch in minimalem Abstand voneinander auftauchen, um die Dauer eines Trennvorgangs möglichst gering zu halten. Um dem zeitaufwändigen und kostspieligen Bestimmen der Parameter nach der Trial-and-Error-Methode auszuweichen, bedienen sich chemische, pharmazeutische und die Nahrungsmittelindustrie oft einer Simulationssoftware wie DryLab (das älteste Programm dieser Art); solche Programme können, auf experimentellen Daten oder Molekülstrukturen der Proben beruhend, passende Methoden prognostizieren.

Aktuelle Entwicklungen

Zur Zeit herrscht der Trend, immer höheren Probendurchsatz zu erreichen. Die Hersteller von HPLC-Anlagen haben hierzu unterschiedliche Begriffe geprägt:

• RRLC ^[2] : Rapid Resolution Liquid Chromatography
• RSLC ^[2] : Rapid Separation Liquid Chromatography
• UFLC ^[2] : Ultra Fast Liquid Chromatography
• UPLC ^[2] : Ultra Performance Liquid Chromatography

Hierbei werden Partikel mit einem Durchmesser von weniger als 2,5 μm als Säulenmaterial genutzt. Dadurch können Geschwindigkeit und Effizienz einer chromatografischen Auftrennung deutlich verbessert werden. Allerdings ist für die Durchführung einer Trennung mit einem solchen Säulenmaterial ein deutlich höherer Arbeitsdruck erforderlich, der von klassischen HPLC-Anlagen nicht erreicht werden kann. Sowohl die Säulen als auch die anderen Bauteile wie Injektionsgeber, Pumpen und Ventile müssen unter diesen Bedingungen zuverlässig arbeiten, was die Entwicklung neuer Geräte nötig machte.

Bei diesen Verfahren wird die Analysenzeit durch optimierte Anlagenbauteile verkürzt (z. B. schnelle, verschleppungsarme Probengeber, empfindliche Detektoren, geringe Gradientenverzögerung)

Detektoren

• UV/VIS-Detektor

- Diodenarraydetektor (DAD)

• Lichtstreudetektor
• Fluoreszenzdetektor, dabei wird der Detektor im 90°-Winkel zur Lichtquelle positioniert. Das emittierte Licht ist die Fluoreszenz. Der Vorteil gegenüber dem UV-Detektor ist die etwa tausendfach erhöhte Empfindlichkeit.
• Brechungsindexdetektor
• Massenspektrometer
• Leitfähigkeitsdetektor
• Elektrochemischer Detektor: Amperometrie, Coulometrie
• Radioaktivitäts-Detektor zur Messung radioaktiv markierter Substanzen
• Stickstoffselektiver Detektor

Siehe auch

• Chromatografie
• Ionenaustauschchromatografie

Fußnoten und Einzelnachweise

1. ↑ www.kromidas.de/Uploads/Dokumente/HPLCfuerNeueinsteiger.pdf
2. ↑ ^{a b c d} Diese Begriffe sind alle mehr oder weniger Handelsnamen und daher nicht ohne Zustimmung des Herstellers zu benutzen. Als neutrale Bezeichnung für HPLC mit stark gesteigerter Leistung ist UHPLC (ultra high performance liquid chromatography) geeignet. Diese Bezeichnung ist analog zu „high frequency“ (HF) und „ultra high frequencey“ (UHF) oder „high temperature“ (HT) und „ultra high temperature“ (UHT) zu verstehen.

Weblinks

• Umfangreiche Übersicht von Herstellern für HPLC-Systeme
• Basiswissen HPLC (englisch)
• HPLC-Links
• HPLC-Tipps