Fluoreszenzfarbstoff

Dunkelgrüne Fluorit-Zwillingskristalle (links) unter kurzwelligem UV-Licht (rechts)

Fluoreszenz ist die kurzzeitige, spontane Emission von Licht beim Übergang eines elektronisch angeregten Systems in einen Zustand niedrigerer Energie, wobei das emittierte Licht im Regelfall energieärmer ist als das vorher absorbierte. Im Gegensatz zur Phosphoreszenz sind Fluoreszenzübergänge spinerlaubt, d. h. sie gehorchen der Auswahlregel ΔS = 0, erfolgen also zwischen Zuständen gleichen Spins.

Typische Fluorophore, also physikalische Systeme, bei denen Fluoreszenz auftritt, sind Atome, Moleküle, Ionen und Halbleiternanopartikel.

Der Name Fluoreszenz ist von dem fluoreszierenden Mineral Fluorit (Flussspat, Calciumfluorid, CaF₂) abgeleitet in Analogie zur Opaleszenz zum Opal. ^[1] Auch der Name des Elementes Fluor hängt mit diesem Mineral zusammen.

Phosphoreszenz / Fluoreszenz

Sowohl Fluoreszenz als auch Phosphoreszenz sind Formen der Lumineszenz (kaltes Leuchten). Fluoreszenz ist jedoch dadurch gekennzeichnet, dass sie nach dem Ende der Bestrahlung rasch (meist innerhalb einer Millionstel Sekunde) endet. Bei der Phosphoreszenz hingegen kommt es zu einem Nachleuchten, das von Sekundenbruchteilen bis hin zu Stunden dauern kann.

Erklärung

Wird der Fluorophor optisch, also durch die Absorption eines Photons, angeregt, und deaktiviert anschließend unter Aussenden von Licht, so spricht man von Photolumineszenz. Bedingung für die Absorption von elektromagnetischer Strahlung ist die Parallelität des Übergangsdipolmoments des Moleküls mit der Schwingungsebene der elektrischen Feldkomponente des Photons. Je größer der Winkel zwischen diesen beiden, desto unwahrscheinlicher wird die Absorption und damit die Fluoreszenz.

Der angeregte Fluorophor verweilt nach der Absorption eine bestimmte Zeit im angeregten Zustand. Diese Zeit wird im Allgemeinen als Lebensdauer oder im Speziellen auch als Fluoreszenzlebensdauer bezeichnet. Da bei diesem Prozess keine Spinänderung erfolgt, ist diese Lebensdauer in der Regel recht kurz (einige Nanosekunden). Nach dem Verweilen im angeregten Zustand kann die Anregungsenergie sowohl in einem strahlenden Kanal (Fluoreszenz) als auch in einem nicht strahlenden (z. B. Schwingungsrelaxation) abgegeben werden, woraufhin anschließend der Fluorophor in seinen Grundzustand zurückkehrt.

Bei beiden Kanälen ist zu beachten, dass die Gesamtenergie die vom System abgegeben wird, aufgrund der Energieerhaltung immer gleich der Anregungsenergie ist. Daraus ergibt sich unmittelbar die Stokessche Regel. Die besagt, dass die Wellenlänge des emittierten Photons in der Regel nie kleiner sein kann, also immer gleich groß oder größer ist als die des absorbierten Photons (längere Welle heißt weniger Energie). Im Falle von exakt gleichen Wellenlängen spricht man von Resonanzfluoreszenz, ansonsten bewirkt der durch die Schwingungsrelaxation verursachte Energieverlust eine langwellige Verschiebung der emittierten Energie (Stokesverschiebung). Die Wahrscheinlichkeit, mit der die Anregung eines Fluorophors tatsächlich zur Emission eines Fluoreszenzphotons führt, nennt man seine Quantenausbeute.

Deaktivierung

Nichtstrahlende Deaktivierungsprozesse können durch Gegenwart bestimmter Stoffe, sogenannter Quencher gefördert werden. Das Phänomen, dass durch diese Konkurrenzprozesse die Fluoreszenz vermindert wird, wird als Fluoreszenzlöschung (quenching) bezeichnet. Ein wichtiger Quencher, besonders für die Fluoreszenz organischer Fluorophore, ist Sauerstoff (O₂). Hierauf beruhen Verfahren zur Bestimmung der Stoffkonzentration von Sauerstoff in der Sensorik (Sauerstoffsensor), z. B. zur Überwachung der Sauerstoffkonzentration in der Luft. Die Abhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeute von der Konzentration eines Quenchers wird oft durch die Stern-Volmer-Gleichung gut beschrieben.

In einem alternativen, nicht strahlenden Prozess kann das angeregte Elektron durch ein sog. intersystem crossing seinen Spin zum in der Regel energetisch tiefer liegenden Triplettzustand (Ausnahme: z. B. molekularer Sauerstoff) ändern. Von hier aus sind wiederum beide Deaktivierungskanäle offen, wobei der strahlende, d. h. Licht emittierende, als Phosphoreszenz bezeichnet wird.

Anwendungsgebiete

Im Folgenden sollen einige Methoden und Anwendungsgebiete genannt werden:

Fluoreszenzspektroskopie

Der Begriff der Fluoreszenzspektroskopie stellt einen Sammelbegriff dar, der alle Methoden zusammenfasst, die die Fluoreszenzeigenschaften von Fluorophoren ausnutzen, um Informationen über die untersuchten Systeme zu gewinnen. Es gibt viele natürliche und synthetische Verbindungen, die Fluoreszenz zeigen.

Siehe auch: Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, Fluoreszenzpolarisation

Aufhellung / Dekoration

Durch die Absorption (unsichtbaren) ultravioletten und blauen Lichts und die Aussendung längerwelligen sichtbaren Lichts lässt sich eine Aufhellung erzielen:

• Optische Aufheller
• Signalfarbe (Tagesleuchtfarbe)
• Textmarker (Tagesleuchtfarbe)

Kunst mit fluoreszierenden Materialien und UV-Licht.

In Diskotheken wird oft sogenanntes Schwarzlicht (UV-Licht, UV-A) benutzt, um fluoreszierende Farben, chininhaltige Getränke oder optische Aufheller in Kleidung zum Leuchten zu bringen. Bekannt sind auch Tafeln, die mit fluoreszierender Kreide beschrieben werden können. Sie können von außen oder auch von innen (Flutlicht) durch das transparente Tafelmaterial mit Ultraviolett beleuchtet sein.

Tagesleuchtfarbe fluoresziert bereits durch die Anregung mit dem Blauanteil des Tageslichtes. Da dieser bei schlechtem Wetter und in der Dämmerung besonders hoch ist, wird eine bessere Sichtbarkeit erreicht. Tagesleuchtfarbe gibt es auch in wasserlöslicher Form.

Beleuchtung

Beispiele für Leuchtstofflampen

In Leuchtstofflampen wird ultraviolettes Licht, das durch Gasentladung in der mit Quecksilberdampf gefüllten Röhre erzeugt wird, in sichtbares Licht umgewandelt. In weißen Leuchtdioden (LED) wandelt ein Fluoreszenzfarbstoff das blaue Licht, das ein Halbleiterkristall erzeugt, in weißes Licht um.

Technische Fluorophore bestehen aus Stoffen wie Zinksulfid oder den Oxiden der Selten-Erd-Metalle. Werden diese Verbindungen mit so genannten Aktivatoren dotiert, lassen sich verschiedene Farben erzeugen. Als Aktivatoren werden häufig zwei- und dreiwertige Lanthanoid-Kationen verwendet. Zweiwertige Europium-Kationen erzeugen beispielsweise blaues Licht während die dreiwertigen rotes Licht emittieren. Grünes Licht entsteht beispielsweise durch Cu⁺- und Al³⁺-dotiertes Zinksulfid.

Durch geeignete Komposition (Mischung) der Leuchtstoffe lässt sich ein großes Spektrum an nutzbaren Lichtwellenlängen und Farbtemperaturen realisieren, wodurch das Leuchtmittel auf den jeweiligen Anwendungsfall angepasst werden kann. In Leuchtstofflampen wird z. B. in Abhängigkeit vom verwendeten Leuchtgas das Spektrum des Sonnenlichtes (kaltweiß) oder das einer Glühlampe nachgeahmt.

Auch Tritiumgaslichtquellen nutzen die Fluoreszenz eines Leuchtstoffes, der durch die Betastrahlung des Tritium angeregt wird.

Anzeigen, Displays und Bildschirme

Vakuum-Fluoreszenzdisplay, alle Anodensegmente leuchten aufgrund externer Ultraviolett-Bestrahlung

Bei Anzeigen, Displays und Bildschirmen wird oft die Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe durch Elektronenbeschuss genutzt. Beispiele sind Vakuum-Fluoreszenz-Displays (VFD), Fernseh- und Monitor-Kathodenstrahlröhren und Oszillografenröhren (CRT), Digitrons und Abstimmanzeigeröhren.
Diesen gemeinsam ist die Freisetzung von Elektronen durch Glühemission im Vakuum und deren Beschleunigung auf eine Leuchtstoffschicht durch eine elektrische Spannung.

Biochemie und Medizin

Illustration von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen in Bakterien.

Mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarose-Gel.

An große Biomoleküle kann durch eine chemische Reaktion eine fluoreszierende chemische Gruppe angehängt werden, die dann als sehr sensitiver Marker für dieses Molekül dient. Beispiele:

• Bei der automatischen Sequenzierung der DNA mit der Sanger-Methode hat jede der vier terminierenden Nukleinbasen eines DNA-Stückes ihren spezifischen fluoreszierenden Marker. Wenn die markierten DNA-Moleküle getrennt werden, werden die Marker durch UV-Licht angeregt, und die Identität der Marker wird anhand der Wellenlänge des emittierten Lichtes festgestellt.
• Die Verbindung Ethidiumbromid zeigt kaum Fluoreszenz, wenn sie in einer Lösung ihre Konformation frei ändern kann. Durch Bindung an DNA wird die Fluoreszenz jedoch stark erhöht, was sie nützlich bei der Lokalisierung von DNA-Fragmenten macht, z. B. bei der Agarose-Gelelektrophorese.
• Die Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin fluoreszieren bei Anregung durch UV-Licht, wobei auch bei Proteinen und Peptiden, die diese Aminosäuren enthalten, Fluoreszenz beobachtet werden kann.
• Auf DNA-Chips und Protein-Chips wird Fluoreszenz für die Detektion verwendet.
• In der Immunologie werden Antikörper mit einer fluoreszierenden chemischen Gruppe versehen, so dass die Orte (z. B. eines mikroskopischen Objektes), an die die Antikörper binden, anhand der Fluoreszenz erkennbar sind. Die Antigen-Konzentration kann damit sogar quantitativ bestimmt werden.
• Diagnostik der Stoffwechselerkrankungen der Häm-Bildung (Porphyrien): Die Vorläuferstoffe des Häms (Porphyrine) floureszieren bei geeigneter Anregung, so dass über hochleistungsfähige chromatographische Verfahren (HPLC) quantitative Messungen in Blut-, Stuhl- und Urinproben möglich sind.
• Fluoreszierende Proteine wie das GFP (Green fluorescent protein) dienen als Marker für verschiedenste biologische Vorgänge innerhalb der Zellen wie zum Beispiel die Genexpression.
• Die Aktivierung eines fluoreszierenden Akzeptors nach Fluoreszenzanregung eines benachbarten Donors durch FRET (Fluorescence resonance energy transfer) wird in der Biochemie und der Zellbiologie zu Abstandsmessungen im Nanometerbereich genutzt.
• Markierung von Proteinen für die differentiellen 2D-PAGE (2D-DIGE)
• FACS (Fluorescent activated cell sorter oder Durchflusscytometrie)
• FISH (Fluorescence in situ hybridization) Chromosomenanalyse
• Beobachtung einzelner Moleküle mittels Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie
• Die Vital-Fluoreszenz-Doppelfärbung dient der Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen.

Mineralogie, Gemmologie (Edelsteinkunde) und Forensik

Fluoreszierende Minerale

Mineralien, Edelsteine, Fasern und viele andere Materialien, die in der Forensik oder an Sammlerstücken und Antiquitäten untersucht werden, haben unterschiedliche Fluoreszenzeigenschaften, wenn sie mit kurz- oder langwelligem UV-Licht oder mit Röntgenstrahlen bestrahlt werden, und können dadurch identifiziert werden.

Kosmische Strahlung

Hochenergetische Kosmische Strahlung löst in der Erdatmosphäre Teilchenkaskaden, sog. ausgedehnte Luftschauer, aus. Die geladenen Teilchen dieser Schauer regen die Stickstoffmoleküle der Luft an, so dass diese Fluoreszenzlicht ausstrahlen. Durch Messungen dieses Lichtes lassen sich Rückschlüsse auf die primäre kosmische Strahlung gewinnen. Ähnliche Phänomene sind das Polarlicht, bei dem die Anregung der Luftmoleküle in erster Linie durch die Teilchen des Sonnenwindes erfolgt, und die Strahlung des leuchtenden Komentenschweifs, bei dem infolge der Wechselwirkung mit dem Sonnenwind Moleküle Licht ausstrahlen.

Biologie und Paläontologie

Euscorpius italicus unter UV-Licht

Die Cuticula der Skorpione fluoresziert bei Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlung. Dabei werden eingelagerte beta-Carboline und 7-Hydroxy-4-methylcoumarin angeregt. Auch nach dem Ableben der Tiere bleibt dieser Effekt erhalten. Mit Hilfe entsprechender Lampen können die Tiere daher bei Dunkelheit leicht entdeckt werden.

Auch in der Paläontologie nutzt man Fluoreszenz zum Auffinden und zur Untersuchung von zahlreichen Fossilien.

Fluoreszierende Farbstoffe (Auswahl)

Nilrot bei Tageslicht (obere Reihe) und UV-Licht (366 nm, untere Reihe) in verschiedenen Lösungsmitteln.
V.l.n.r.: 1. Wasser, 2. Methanol, 3. Ethanol, 4. Acetonitril, 5. Dimethylformamid, 6. Aceton, 7. Ethylacetat, 8. Dichlormethan, 9. n-Hexan, 10. tert-Butylmethylether, 11. Cyclohexan, 12. Toluol.

• Fluoresceine
• Rhodamine
• Cumarine
• Berberin
• Chinin
• DAPI
• Nilrot
• Allophycocyanin
• Indocyaningrün
• Stilbene
• Porphyrine, (Häme, Chlorophylle etc.)
• Fluoreszierende Proteine
• Quadraine (Quadratsäurefarbstoffe) auf Basis von N,N-Dialkylanilinen
• 1,3,2-Dioxaborine (Komplexe von Borsäurederivaten mit 1,3-Dicarbonylverbindungen)

weitere Farbstoffe: in der Kategorie Fluoreszenzfarbstoff

Siehe auch

• Parametrische Fluoreszenz
• (Sensibilisierte) Chemolumineszenz

Einzelnachweise

1. ↑ Stokes G. G. (1852) Phil. Trans. 142, 463-562

Weblinks

• Fluorophores.org – Datenbank für Fluoreszenzfarbstoffe
• Fluoreszenz von Mineralien Mineralienatlas
• Fluoreszenz Universität Jena
• Maßgeschneiderte Medikamente per Laser Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) an der Universität Bonn
• Lichtmikroskopie online Universität Wien
• Fluorescence Microscopy Umfangreiches interaktives Tutorial (englisch)
• Basic Principles of Fluorescence Spectroscopy Tutorial auf englisch