Hefezelle

Candida albicans

Die Hefen sind einzellige Pilze, die sich durch Sprossung oder Teilung (Spaltung) vermehren und meist aus der Abteilung der Schlauchpilze (Ascomycota) stammen. Es werden aber auch Entwicklungsstadien anderer Pilze als Hefen bezeichnet. Beispiele für Ständerpilz-Hefen (Basidiomycota) sind die Sprossstadien der verschiedenen Nacktbasidien-Arten (Exobasidium), bestimmte Entwicklungsstadien vieler Brandpilze oder sogar fakultativ humanpathogene Pilze wie Malassezia furfur.

Geschichte und Bedeutung

Hefen sind die wichtigste Gruppe von Mikroorganismen mit kommerzieller Bedeutung. Sie stehen seit einigen tausend Jahren im Dienste der Menschheit. Schon in den frühen Hochkulturen des Mittleren Ostens wurden alkoholische Getränke wie Wein und Bier und aufgegangenes Brot genossen. Hier kannte man zwar die Anwendung von Hefe als Masse, aber man wusste nicht, dass es sich um Lebewesen handelt. So erwähnt zum Beispiel das bayerische Reinheitsgebot von 1516 keine Hefe, obwohl man wusste, dass sie zur Bierherstellung erforderlich ist.

Erst Louis Pasteur (1822–1895) beschrieb in seiner Arbeit Études sur la bière, dass die Hefe aus Mikroorganismen besteht und die Anwesenheit dieser Organismen von essentieller Bedeutung für den Gärungsprozess ist. Pasteur bewies, dass ohne Hefe keine Fermentation stattfindet, und die Anwesenheit anderer Organismen (wilde Hefen oder Bakterien) das Gärverhalten mit dem Ergebnis verdorbener Biere oder Weine störte. Hefen werden in der Produktion von Bier, Wein, Spirituosen, Lebensmitteln sowie einer Vielzahl biochemischer und therapeutischer Substanzen angewendet. Einige Hefen verursachen Verderbnis von Futter und Lebensmitteln, andere haben medizinische Bedeutung.

Hefen spielen in der Biologie eine wichtige Rolle als Modellorganismen, da sie sich leicht im Labor kultivieren, genetisch verändern und untersuchen lassen. Sie gehören zu den kleinsten eukaryotischen Organismen. Da es sich um Eukaryoten handelt, ist ihre Ähnlichkeit zu höheren Organismen deutlich größer als die der Bakterien.

Biologie

Hefen sind einzellige Sprosspilze (Ascosporidae). Die Vermehrung findet asexuell durch Sprossung oder Teilung statt. Auch sexuelle Fortpflanzung kommt vor, bei Ascosporidae mit Ascus- und Ascosporenbildung, bei Basidiosporidae mit Basidiosporenbildung.

Als Eukaryoten sind Hefen im Allgemeinen wesentlich größer als die weitaus meisten Bakterien und zeigen ähnliche Zellstrukturen wie Säugetiere und Pflanzen. Eukaryoten besitzen komplexe Membranstrukturen, Chromosomen und eine Vielzahl von Organellen einschließlich der Mitochondrien und des endoplasmatischen Retikulums, Strukturen, die bei Prokaryoten (hauptsächlich Bakterien) nicht vorhanden sind.

Etwa 700 Hefearten sind heute mit über 5.000 Stämmen bekannt, aber nur wenige wurden genau beschrieben. Derzeit existiert keine verbindlich abgrenzende Definition für Hefen, denn die allgemein bekannten Eigenschaften wie alkoholische Gärung und Wachstum durch Zellteilung sind nicht allen Hefen gemein und nicht nur ihnen eigen.

Die meisten Hefen sind fakultativ anaerob, also nicht auf Sauerstoff angewiesen. Sie können bei Verfügbarkeit von Sauerstoff, wie die meisten anderen Lebewesen, ihn für einen oxidativen Energiestoffwechsel nutzen: Sie können verschiedene Zucker zu den sehr energiearmen Produkten Kohlenstoffdioxid und Wasser oxidieren. In Abwesenheit von Sauerstoff aber können sie die Zucker nur zu dem Produkt Ethanol, welches noch viel Energie in sich trägt, und zu Kohlenstoffdioxid abbauen (Gärung). Die Zucker-Oxidation zu Kohlenstoffdioxid und Wasser liefert dementsprechend viel Energie (Energiedifferenz zwischen Anfangs- und Endprodukten), die Vergärung zu Ethanol und Kohlenstoffdioxid wesentlich weniger. Deshalb sind die Massenzuwachsrate und die Zellteilungsrate bei oxidativem Zuckerabbau sehr viel höher als bei der Gärung.

Hefen nutzen ein breites Spektrum an Kohlenhydraten. Jedoch wurde bisher keine Spezies beschrieben, die alle in der Natur vorkommenden Zucker nutzen kann. Einige Beispiele: Die obergärigen Stämme der Hefe Saccharomyces cerevisiae können Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Saccharose, Maltose, Maltotriose und Raffinose nutzen. Die nah verwandte Art Saccharomyces diastaticus und die untergärigen Stämme von Saccharomyces cerevisiae (früher als Arten S. uvarum oder S. carlsbergensis angesehen) nutzen außerdem Dextrine und Melobiose. Saccharomyces cerevisiae und ihre Verwandten können jedoch nicht Pentosen wie Ribose, Xylose und Arabinose und auch nicht Cellobiose, Lactose, Inulin und Cellulose nutzen.

Arten

Einige Hefe-Arten als Beispiele:

Schizosaccharomyces pombe

eine Spalt-Hefe (engl. „fission yeast“)

Saccharomyces cerevisiae

(Backhefe / Bäckerhefe, Obergärige Bierhefe) ist eine Knospungs-Hefe (engl. „budding yeast“) und wurde erstmals 1888 von Emil Christian Hansen isoliert. Sie wird als Reinzucht obergäriger Stämme vorwiegend aerob in Nährlösungen hergestellt und kommt als Trockenhefe oder Presshefe in den Handel. Obergärige Stämme steigen beim Bierbrauen während der Gärung nach oben und schwimmen auf dem Substrat. Untergärige Stämme sinken dagegen gegen Ende der Hauptgärung nach unten.

Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces uvarum und andere

Untergärige Hefen fermentieren mehr Zuckerarten, auch bei niedrigeren Temperaturen. Sie werden zur Herstellung von Lager-Bier verwendet.

Candida utilis

spielt bei der Herstellung von Kefir eine Rolle.

Candida albicans

besiedelt als Saprophyt Schleimhäute, Haut sowie Verdauungstrakt und ist bei Dreiviertel aller Menschen zu finden. Löst nur unter gewissen Umständen Krankheiten aus („Schwächeparasit“).

Saccharomyces boulardii

wird zur symptomatischen Behandlung von Durchfall genutzt

Brettanomyces bruxellensis

Schädlingshefe in Most und Wein, die das so genannte „Pferdeschweiß“-Aroma verursacht. Andererseits wird sie zur Herstellung des belgischen Biers Lambic genutzt.

Pichia pastoris

Wird in biotechnischen Verfahren zur Produktion von Proteinen benutzt.

Malassezia furfur

Ist unter Anderem für die vermehrte Schuppenbildung, besonders auf der Kopfhaut, verantwortlich.

Biotechnische Verwendung

Hefen werden für eine Vielzahl biotechnischer Verfahren verwendet. Die bekannteste ist die Herstellung Ethanol-haltiger Getränke, wie Bier oder Wein (und weitere alkoholische Getränke) sowie das Ethanol selbst. Insbesondere Zuckerhefen (Saccharomyces) werden für die Brot- („Weißbäckerei“, Hefeteig) und Bierproduktion verwendet.

Enthält die zu vergärende Flüssigkeit Pektin, entsteht bei der Gärung Methanol, das im menschlichen Körper zu Methanal (Formaldehyd) und in der Folge zu Methansäure (Ameisensäure) abgebaut wird und zum Erblinden führen kann. Bei der Herstellung von stark alkoholhaltigen Getränken durch Destillation („Schnapsbrennen“) wird ein großer Teil des Methanols im Vorlauf abgetrennt.

Obgleich die Taxonomie (biologisch systematische Einordnung) der Hefen Kontroversen bietet, sind mindestens 1.000 separate Stämme von Saccharomyces definiert. Die Industrie richtet ihr Augenmerk eher auf Eigenschaften einzelner Stämme als auf taxonomische Gesamtklassifikationen. Für die Taxonomie „unbedeutende“ Unterschiede zwischen Stämmen wie Ober- oder Untergärigkeit sowie Temperaturoptima können in der technischen Anwendung von entscheidender Bedeutung sein. Die klassische Hefezucht erscheint schwierig, da die meisten industriell genutzten Stämme polyploid oder aneuploid sind und in der Konsequenz keinen haploid-diploiden Lebenszyklus aufweisen. Diese Stämme sind daher zwar genetisch stabiler, bieten aber kaum geeignete Fortpflanzungsaktivitäten zur Nutzung klassischer Zuchtmethoden. Techniken mit Sphäroblastenbildung und rekombinanter DNA führen jedoch zur Erzeugung weiterer Hefestämme mit industriellem Potential. Diese Techniken sind weit fortgeschritten und insbesondere in der Mikrobiologie schon lange Praxis, an der Akzeptanz durch die europäische Öffentlichkeit mangelt es jedoch noch.

Industrielle Bedeutung

Die Gesamtmenge der heute produzierten Hefen einschließlich derer, die durch Brauen, Weinherstellung und Lebensmittelproduktion anfallen, geht in die Millionen Tonnen jährlich. Obwohl Hefen der Art Saccharomyces cerevisiae die wesentliche ökonomisch bedeutsame Form darstellen, gibt es zahlreiche „exotische“ Hefearten mit weiterem potentiellem Nutzen für technische Anwendungen. Die meisten Saccharomyces-Hefen gelten weltweit generell als sicher im Sinne des Lebensmittelrechts (GRAS – Generally Recognized As Safe) und produzieren zwei sehr wichtige primäre Stoffwechselprodukte, Ethanol und Kohlendioxid.

Ethanol wird als Trinkalkohol, als Kraftstoff sowie als Lösungsmittel genutzt. Die Anwendung von Kohlendioxid reicht von dem Treiben des Backteigs, Kohlensäuren für Getränke, der Produktion von Hopfenextrakt bis hin zur Anwendung in Gewächshauskulturen. Hinzu kommen weitere wichtige Anwendungen der Hefe selbst. Extrakte aus Hefe können den Geschmack würziger Lebensmittel abrunden und bieten als Nukleotidquelle einen wichtigen Bestandteil von Muttermilchersatzprodukten. Den Verbrauchern und auch Tierernährern ist Hefe als Lieferant von Vitamin B wohl vertraut. Sterile Hefeextrakte dienen als Nährmedium für die Zucht weiterer Pilztypen in der Enzymproduktion oder für die Produktion von Bakterien für Probiotika und Siliermittel.

Der Aufbau der Zellwand einiger Saccharomyces ist über das Aufzuchtmillieu (Gärführung, Ernährung) gezielt steuerbar, was diesen Organismus in der Biotechnologiebranche sehr beliebt macht. Der gitterartigen Glucanfraktion der Zellwand einiger Stämme sind toxinbindende Eigenschaften nachgewiesen. Definierte Mannanoproteine ermöglichen die Kontrolle pathogener Bakterien oder dienen als orale „Promoter“ von Vakzinen und Medikationen. Anwendungen, die auch für die Tierernährung interessant werden könnten. Die gut beschriebene Nährstoffsynthese von Hefen erlaubt die Herstellung von Aminosäuren und organisch gebundener Spurenelemente für die Human- und Tierernährung. Der Einsatz der Gentechnik führte zu zahlreichen anderen wichtigen Anwendungen der Hefe einschließlich Kulturen, die durch genetische Veränderungen nicht-hefetypische Proteine und Peptide wie Interferon, humanes Serumalbumin oder Insulin produzieren.

Vorteile von Hefen als „Expressionsplattformen“

Hefen bestehen aus einer Vielzahl höchst unterschiedlicher Organismen und nicht nur aus der allgemein vom Backen oder Brauen bekannten Bäcker- oder Bierhefe Saccharomyces cerevisiae.

Hefen sind ideale Systeme für die Produktion von Fremdproteinen. Als Eukaryoten sind sie in der Lage, Proteine zu glykosylieren, sie sind also in der Lage, Zuckerketten an die Proteine anzuheften: viele Proteine sind Glykoproteine. Ferner sind sie in der Lage, diese Glykoproteine in das sie umgebende Nährmedium zu sezernieren – das Darmbakterium E. coli kann dies zum Beispiel nicht. Die in Hefen hergestellten Proteine sind damit identisch oder sehr ähnlich den Proteinen der Tiere oder des Menschen.

Die erste auf einer Hefeart beruhende „Expressionsplattform“ („Proteinfabrik“) nutzte die bereits erwähnte Bäckerhefe. Es gibt jedoch mehr als 800 verschiedene Hefearten mit höchst unterschiedlichen Eigenschaften. Einige davon sind für ihr Wachstum, im Unterschied zur Bäckerhefe, nicht auf Traubenzucker als Kohlenstoffquelle beschränkt, sondern können eine Vielzahl unterschiedlicher Substrate nutzen. Verschiedene dieser Hefen werden – wie die Bäckerhefe – für die gentechnische Herstellung von Proteinen genutzt.

Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans)

Arxula adeninivorans ist eine dimorphe Hefeart (sie wächst in Hefeform unterhalb einer Temperatur von 42 °C, oberhalb dieser Temperatur in filamentöser Form). Sie kann auf höchst unterschiedlichen Energie- und Kohlenstoffquellen wachsen und Nitrat assimilieren. Sie wurde für die Produktion unterschiedlicher Proteine eingesetzt – in speziellen Anwendungsbeispielen wurden gentechnisch veränderte Hefestämme erzeugt mit der Fähigkeit, biologisch abbaubares Plastik herzustellen oder Biosensoren für die Messung von Östrogenen in Umweltproben entwickelt.

Candida boidinii

Candida boidinii ist eine methylotrophe Hefeart (d. h. sie ist zum Wachstum mit Methanol-Oxidation als Energiequelle und Methanol als Kohlenstoffquelle fähig). Wie andere methylotrophe Hefearten (siehe nachfolgend Hansenula polymorpha und Pichia pastoris) bietet sie eine exzellente Plattform für die Produktion von Fremdproteinen. Für sie wurden Produktivitäten von vielen Gramm pro Liter Kultur beschrieben.

Hansenula polymorpha (Pichia angusta)

Hansenula polymorpha ist eine methylotrophe Hefeart (siehe Candida boidinii). Sie kann außerdem auf einer Vielzahl anderer Substrate wachsen, ist ein thermo-toleranter Mikroorganismus und kann Nitrat assimilieren. Sie wurde unter anderem für die Produktion von Hepatitis-B-Impfstoffen, von Insulin und Interferon-alpha2a für die Behandlung von Hepatitis C genutzt, darüber hinaus für die Herstellung verschiedener technischer Enzyme.

Kluyveromyces lactis

Kluyveromyces lactis ist eine Hefeart, die für die Produktion von Kefir eingesetzt wird. Sie kann auf verschiedenen Zuckern wachsen, besonders wichtig ist dabei der Zucker Laktose, der in Milch und Molke vorkommt. Sie wurde unter anderem nach gentechnischer Veränderung für die Produktion von Chymosin, dem Labferment, für die Dicklegung der Milch bei der Käseherstellung eingesetzt. Die Produktion des Chymosins findet in großen Fermentern im 40.000 l Maßstab statt.

Pichia pastoris

Pichia pastoris ist eine weitere methylotrophe Hefeart (vergl. Candida boidinii und Hansenula polymorpha). Für diese „Plattform“ sind verschiedene Elemente als Kit erhältlich; sie wird weltweit in Universitäten und akademischen Einrichtungen für die Proteinproduktion eingesetzt. In jüngerer Zeit wurden Stämme entwickelt, die die komplexen Zuckerketten von menschlichen Proteinen völlig authentisch herstellen (Hefezuckerketten in Hefeproteinen sind normalerweise ähnlich, aber nicht völlig identisch).

Saccharomyces cerevisiae

Der Ausdruck “Hefe” bezeichnet einen Sammelbegriff, wird aber oft nur für diese Hefeart, die traditionelle Bäcker- oder Bierhefe Saccharomyces cerevisiae, benutzt, weil dies die ursprüngliche Bedeutung des Wortes „Hefe“ ist. Saccharomyces cerevisiae wurde und wird unter anderem für die Herstellung von technischen Enzymen, aber auch von pharmazeutischen Wirkstoffen wie Insulin und Hepatitis B-Impfstoffen genutzt.

Yarrowia lipolytica

Yarrowia lipolytica ist eine dimorphe Hefeart (vergl. Arxula adeninivorans), die wie andere bereits beschriebene Arten auf unterschiedlichen Substraten wachsen kann. Sie hat ein hohes Potenzial für industrielle Anwendungen, es gibt allerdings noch kein kommerziell erhältliches gentechnisches Produkt, das mit Hilfe dieser Hefe hergestellt worden ist.

Vergleich der verschiedenen Hefen

Die diversen Hefe-Arten unterscheiden sich bei bestimmten Produktentwicklungen erheblich. Zudem müssen aus den so genannten Wildtypen zunächst „gentechnische Proteinfabriken“ werden. Geeignete Hefestämme müssen dazu mit Hilfe eines Vektors (konkret: mit Hilfe eines Plasmids) transformiert werden. Ein solches Plasmid enthält alle notwendigen genetischen Elemente für das Erkennen eines transformierten Stammes und die genetische Anleitung für die Produktion des gewünschten Proteins. Diese Elemente werden im Folgenden kurz zusammengefasst:

1. Ein Selektionsmarker, der notwendig ist, um einen transformierten Stamm von nicht-transformierten Stämmen zu unterscheiden – dies kann zum Beispiel durch ein genetisches Element erreicht werden, das einen defekten Stamm in die Lage zurückversetzt, in Medien zu wachsen, in denen ein unverzichtbarer Stoff fehlt, die der Stamm aufgrund seines Defektes selbst nicht mehr produzieren kann, etwa eine bestimmte Aminosäure.
2. Bestimmte Elemente, um die Plasmide nach Aufnahme zu vermehren oder in eine bestimmte Stelle des Hefechromosoms zielgerichtet einzubauen (ARS und/oder rDNA- Sequenz).
3. Ein DNA-Segment, das für die Synthese des erwünschten Proteins verantwortlich ist, eine so genannte Expressionskassette. Eine solche „Kassette“ besteht aus einer Abfolge regulatorischer Abschnitte: zunächst enthält sie einen Promotor, durch den kontrolliert wird, in welchem Umfang und unter welchen Umständen eine nachfolgende Sequenz abgelesen (Transkription der mRNA) und damit, wie viel und unter welchen Umständen Protein hergestellt wird.

Grundstruktur eines Vektors: Dieser Basisvektor enthält alle Elemente für die Vermehrung im E. coli-System und eine Multicloning Site (MCS) für die Integration von Modulen für ARS, rDNA, Selektionsmarker und Expressionskassetten. Dazu wurden die ARS-Fragmente mit den Restriktionsorten für SacII und BcuI, die rDNA-Region mit BcuI und Eco47III, die Selektionsmarker mit Eco47III und SalI und die Promotor-Elemente mit SalI und ApaI flankiert.^[1]

Dies bedeutet, dass die nachfolgende Sequenz variabel entsprechend dem zu produzierenden Stoffs ist. Sie kann zum Beispiel die Aminosäuresequenz für Insulin, Hepatitis B-Oberflächenantigene oder Interferon festlegen. Die Expressionskassette wird durch eine nachfolgende Terminatorsequenz begrenzt, durch die eine korrekte Beendigung der Transkription erfolgt. Die Promotorelemente für die Kontrolle der Transkription stammen von sehr aktiven Genen der einzelnen Hefearten, bei Hansenula polymorpha etwa von Genen des Methanolstoffwechsels. Sie sind stark und können darüber hinaus durch Zugabe bestimmter Kohlenstoffquellen in ein Kulturmedium reguliert werden. Die meisten der Promotoren sind wie die soeben benannten nur in einem einzigen System, nämlich dem, aus dem sie stammen, funktionstüchtig.

Es hat sich herausgestellt, dass die verschiedenen Hefearten höchst unterschiedlich in ihrer Fähigkeit sind, bestimmte Proteine zu produzieren. Es gibt dabei Unterschiede in der Prozessierung und Modifikation und generell in der Produktivität. Da sie sich unterscheiden, kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine zu Beginn einer Prozess- und Produktentwicklung festgelegte Hefe überhaupt nicht oder nur unvollkommen in der Lage ist, den angestrebten Stoff zu produzieren. Dies wiederum kann kostenträchtige und zeitraubende Folgen haben. Es ist daher sinnvoll, zu Beginn einer Entwicklung mehrere Hefearten gleichzeitig auf ihre Fähigkeit zu überprüfen, ein bestimmtes Protein herzustellen. Zu diesem Zweck wurde ein Vektorsystem entwickelt, das in allen bisher untersuchten Hefen funktionstüchtig ist. Es ist modular aufgebaut, enthält eine „universelle“ Zielsequenz, die in allen Hefen in identischer Sequenz vorhanden ist (die rDNA). Innerhalb der Expressionskassette enthält es einen Promotor, der in allen Hefen aktiv ist.

Hefe in der Tierernährung

Neben dem Einsatz von Bier- oder Brauhefe in abgetöteter Form als hoch verfügbarer Proteinquelle kommen seit etwa 20 Jahren spezifische Stämme von Saccharomyces cerevisiae in der Tierernährung als Probiotika zum Einsatz. Der Siegeszug dieser Anwendungsform insbesondere im Wiederkäuerbereich geht auf eine wesentliche Beobachtung aus dem Brauwesen zurück: Zur Stabilisierung des fertigen Jungbieres nutzen Brauer in dem Verfahren des „Kräusens“ eine kleine Hefegabe, die Restsauerstoff verbraucht. In diesem Zusammenhang beschrieb der britische Brauwissenschaftler James Hough 1965 bei dem Stamm S. cerevisiae NCYC 1026 ungewöhnlich hohe sauerstoffzehrende Aktivität. Sein Student, der irische Brauingenieur Pearse Lyons, nutzte 1980 diese Beobachtung erstmalig kommerziell zur Stabilisierung des anaeroben Zustandes im Pansen von Kühen. Heute gehört der Einsatz lebender Hefekulturen in der Fütterung von Wiederkäuern und Pferden weltweit zum Standard.

Weitere für die Tierleistung und Gesundheit relevante Effekte gehen auf milieuprägende und bakterienstimulierende Eigenschaften der noch lebenden Hefen zurück. Verschiedene faserabbauende sowie laktatabbauende Bakterien reagieren auf die Anwesenheit der Hefen durch Erhöhung ihres Stoffwechsels und ihrer Fortpflanzungsaktivitäten. Die genutzten Eigenschaften sind wiederum für einzelne Saccharomyces-Stämme spezifisch. Ebenfalls bekannt sind Stämme mit gegenläufiger Wirkung, wie der Stimulation von Laktatbildnern.

Ausblick

Die Suche nach künftigen Anwendungen für Hefen in der Tierernährung konzentriert sich auf die Erzeugung natürlicher Hemicellulasen und Cellulasen für die Herstellung höherwertiger Proteine und einzelner Aminosäuren aus günstiger Rohware wie Reisschalen oder Nebenprodukten aus der Alkoholindustrie. Weitere Bereiche sind die Erzeugung von Peptiden für die balancierte Jungtierfütterung im Sinne „idealer Proteine“ und die Nutzung von Hefeprotein als Basis zur Chelatierung von Medikamenten und Spurenelementen. Die Zucht und Herstellung von Hefen vom gewünschten Typ erfordert viel Know-how, aber sie ist sehr vielseitig und vor allem sehr sicher. Saccharomyces cerevisiae und ihre Verwandten werden die Menschheit demnach noch lange begleiten.

Siehe auch

• Hefeproduktion
• Hefe-Zwei-Hybrid-System
• Homothallismus
• Arxula adeninivorans

Quellen

1. ↑ http://www.microbialcellfactories.com/content/5/1/33

Literatur

• G. Gellissen (Hrsg.): Production of recombinant proteins – novel microbial and eukaryotic expression systems. Wiley-VCH, Weinheim 2005, ISBN 978-3-527-31036-4

Weblinks

• Informationen zur Verwendung von Hefe zum Bierbrauen
• Backhefe
• Anleitung zur Hefekultivierung für Hobby-Bierbrauer

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