Klonieren

Klonierung (oder Klonieren, engl. molecular cloning) ist in der Molekularbiologie der Überbegriff für mehrere Methoden. Das Ziel dieser Methoden ist die Herstellung und Vervielfältigung eines DNA-Moleküls. Klonen bezeichnet hingegen das Herstellen genetisch identischer Organismen.

Bei der Klonierung wird ein gewünschtes DNA-Fragment (z. B. ein Gen) in einen Vektor (z. B. ein Plasmid) integriert. Eine Wirtszelle, die lediglich der Vermehrung der DNA dient (z. B. das Bakterium Escherichia coli), wird anschließend mit dieser rekombinanten DNA transformiert (Gentransfer). Die Bakterienzellen vermehren sich durch Zellteilung. Das Resultat ist eine Population von Zellen, die alle einen Klon des gewünschten DNA-Fragments enthalten. Durch Isolation der gesamten DNA erhält man nun ein Vielfaches der anfangs eingesetzten Menge. Die bakterielle Wirtszelle vermehrt die gewünschte DNA kostengünstig, präzise und in großer Zahl (i.G. zu in vitro-Verfahren wie PCR).

Ziel einer Klonierung ist, ein DNA-Fragment (z. B. für In situ-Hybridisierungen) zu vermehren, seine Eigenschaften zu untersuchen oder auch daraus ein Protein rekombinant zu exprimieren (beispielsweise bei einer Proteinüberexpression). Solche Proteine spielen eine Rolle

• für therapeutische Zwecke (z. B. Insulin etc.)
• in der Lebensmitteltechnologie (z. B. Lab-Ferment etc.)
• in der Landwirtschaft (z. B. Flavr-Savr-Tomate etc.)

Technik

Schematische Darstellung einer Klonierung mit Restriktion und Religation.

Beim Klonieren werden sogenannte Vektoren ("Genfähren") verwendet. Diese dienen als Transportvehikel zur Übertragung einer bestimmten DNA-Sequenz in die eine Empfängerzelle.

Bei der Plasmidklonierung wird ein Plasmid (z. B. pBR322) mit Hilfe von speziellen Restriktionsenzymen versetzt geschnitten, so dass überhängende Enden (engl. sticky ends, klebrige Enden) entstehen. Die Ziel-DNA, die z. B. in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus genomischer DNA amplifiziert wurde und nun als Insert in den Vektor integriert werden soll, wird mit den gleichen Enzymen geschnitten, so dass komplementäre Enden an Vektor- und Ziel-DNA entstehen. Die zueinander kompatiblen, überhängenden Enden von Vektor und Ziel-DNA finden sich und hybridisieren miteinander. In der nachfolgende Ligation, die durch eine DNA-Ligase (z. B. T4-DNA-Ligase) katalysiert wird, werden die Enden der Einzelstränge miteinander kovalent verbunden.

Schematische Darstellung der Transformation einer rekombinanten DNA in eine Bakterienzelle und anschließender Antibiotika-Selektion.

Es folgt die Transformation kompetenter Bakterienzellen (z. B. E. coli) mit dem Vektor-Insert-Konstrukt. Hat eine Bakteriumzelle das Plasmid ins Zellinnere aufgenommen, so kann diese mit Hilfe eines auf dem Plasmid vorhandenen Antibiotikum-Resistenzgens auf einem Agar-Nährboden (z. B. LB-Medium) wachsen, der das entsprechende Antibiotikum (z. B. Ampicillin) enthält. So werden nur diejenigen Bakterienzellen selektiert, die das Plasmid aufgenommen haben. Durch Vermehrung dieser einzelnen Bakterienzelle entstehen Bakterienkolonien. Alle anderen Bakterienzellen, die kein Plasmid aufgenommen haben, gehen zugrunde.

Zur weiteren Vermehrung impft man mit einer solchen Kolonie ein Flüssigmedium an. Aus einem solchen Ansatz kann eine große Menge Plasmid-DNA isoliert (Plasmidpräparation) werden. Die DNA steht dann für weitere Klonierungen oder Transformationen zur Verfügung.

Alternative Technologien

• Recombineering

Literatur

• Michael Andrew Quail (2001): DNA Cloning. In: Encyclopedia of Life Sciences. doi:10.1038/npg.els.0005344 PDF
• Nancy Trun & Janine Trempy (2003): DNA Cloning. In: Fundamental Bacterial Genetics. ISBN 0632044489 PDF

Siehe auch

• Überexpression eines Proteins
• Entfernen eines Gens (vgl. Knockout-Maus)
• Integration eines Gens ins Genom (vgl. Rekombination)

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Klonen ist dagegen das Duplizieren der genetischen Information eines kompletten Organismus.