Klonierung

Klonierung (oder Klonieren, engl. molecular cloning) ist in der Molekularbiologie der Überbegriff für Methoden zur Gewinnung und identischen Vervielfältigung von Desoxyribonukleinsäure (DNA). Im Gegensatz zum Klonen, dessen Ziel in der Herstellung genetisch identischer Organismen besteht, beschränkt sich die Klonierung auf die Herstellung identischer Moleküle der DNA.

Bei der Klonierung wird ein gewünschtes DNA-Fragment (ein Gen) in einen Vektor (ein Plasmid) integriert. Das Ziel einer Klonierung ist, ein DNA-Fragment (beispielsweise für In situ-Hybridisierungen) zu vermehren, um seine Eigenschaften zu untersuchen. Durch Isolation der gesamten DNA kann ein Vielfaches der anfangs eingesetzten DNA-Menge gewonnen werden, was kostengünstig, präzise und in großer Zahl (i.G. zu in vitro-Verfahren wie PCR) geschieht. Alternativ können die Zellen ein Genprodukt wie Protein rekombinant exprimieren (beispielsweise bei einer Proteinüberexpression). Solche Proteine spielen eine Rolle

• für therapeutische Zwecke (Insulin)
• in der Lebensmitteltechnologie (Lab-Ferment)
• in der Landwirtschaft (Flavr-Savr-Tomate)

Für die Klonierung werden verschiedene Organismen als Wirt genutzt. Bekannte Beispiele sind Bakterienzellen wie das Bakterium Escherichia coli, einzellige Algen oder Pilze (Biotechnologie). Die Wirtszellen vermehren sich dabei durch Zellteilung, wobei auch identische Kopien der zu klonierenden Ziel-DNA hergestellt werden. Das Resultat ist eine Population von Zellen, die alle einen Klon des gewünschten DNA-Fragments enthalten.

Weiterhin kann die Klonierung auch dazu verwendet werden, ein oder mehrere Gene auf fremde Organismen zu übertragen, Stoffwechselprozesse zu verbessern oder Resistenzen zu verleihen (bei Tieren und Pflanzen), was zur Genmanipulation führt.

Technik

Schematische Darstellung einer Klonierung mit Restriktion und Ligation.

Beim Klonieren werden sogenannte Vektoren („Genfähren“) verwendet. Diese dienen als Transportvehikel zur Übertragung einer bestimmten DNA-Sequenz in die einer Empfängerzelle.

Bei der Plasmidklonierung wird ein Plasmid (beispielsweise pBR322) mit Hilfe von speziellen Restriktionsenzymen versetzt geschnitten, so dass überhängende Enden (engl. sticky ends, klebrige Enden) entstehen. Die Ziel-DNA, die in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus genomischer DNA amplifiziert wurde und nun als Insert in den Vektor integriert werden soll, wird mit den gleichen Enzymen geschnitten, so dass komplementäre Enden an Vektor- und Ziel-DNA entstehen. Die zueinander kompatiblen, überhängenden Enden von Vektor und Ziel-DNA finden sich und hybridisieren miteinander. In der nachfolgende Ligation, die durch eine DNA-Ligase (z. B. T4-DNA-Ligase) katalysiert wird, werden die Enden der Einzelstränge miteinander kovalent verbunden.

Schematische Darstellung der Transformation einer rekombinanten DNA in eine Bakterienzelle und anschließender Antibiotika-Selektion.

Es folgt die Transformation kompetenter Bakterienzellen (etwa E. coli) mit dem Vektor-Insert-Konstrukt. Hat eine Bakteriumzelle das Plasmid ins Zellinnere aufgenommen, so kann diese mit Hilfe eines auf dem Plasmid vorhandenen Antibiotikum-Resistenzgens auf einem Agar-Nährboden (LB-Medium) wachsen, der das entsprechende Antibiotikum (Ampicillin) enthält. So werden nur diejenigen Bakterienzellen selektiert, die das Plasmid aufgenommen haben. Durch Vermehrung dieser einzelnen Bakterienzelle entstehen Bakterienkolonien. Alle anderen Bakterienzellen, die kein Plasmid aufgenommen haben, gehen zugrunde.

Zur weiteren Vermehrung impft man mit einer solchen Kolonie ein Flüssigmedium an. Aus einem solchen Ansatz kann eine große Menge Plasmid-DNA isoliert (Plasmidpräparation) werden. Die DNA steht dann für weitere Klonierungen oder Transformationen zur Verfügung.

Alternative Technologien

• Recombineering

Siehe auch

• Überexpression eines Proteins
• Entfernen eines Gens: Knockout-Maus
• Integration eines Gens ins Genom: Rekombination

Literatur

• Michael Andrew Quail: DNA Cloning. In: Encyclopedia of Life Sciences. doi:10.1038/npg.els.0005344 PDF 2001
• Nancy Trun & Janine Trempy: DNA Cloning. In: Fundamental Bacterial Genetics. ISBN 0632044489 PDF2003