Konfokale Mikroskopie

Ein Konfokalmikroskop ist ein Lichtmikroskop mit folgenden Besonderheiten: Im Gegensatz zur normalen Lichtmikroskopie wird nicht das gesamte Präparat beleuchtet, sondern zu jedem Zeitpunkt nur ein Bruchteil davon, in den meisten Fällen nur ein Punkt. Mit diesem Beleuchtungspunkt wird das Präparat Punkt für Punkt abgerastert. Im Mikroskop entsteht also zu keinem Zeitpunkt ein vollständiges Bild, die Lichtintensitäten zu jedem Punkt werden jedoch gemessen, so dass eine anschließende Konstruktion des Bildes möglich ist. Der Vorteil dieser Beleuchtung liegt darin, dass im Strahlengang eine Lochblende (englisch: Pinhole) angebracht werden kann, die Licht, welches von außerhalb der Schärfeebene kommt, blockieren kann. Dadurch verringert sich die Schärfentiefe erheblich, wodurch wiederum die Auflösung entlang der optischen Achse (z-Richtung) steigt.

Heute verbreitete Konfokalmikroskope sind allesamt konfokale Laser-Scanning-Mikroskope (engl. confocal laser scanning microscope, CLSM, auch LSCM). Diese Geräte benutzen Laserlicht um Fluoreszenz-Farbstoffe anzuregen, es handelt sich also um Fluoreszenzmikroskope. Weit verbreitet sind Punktscanner, bei denen ein fokussierter Laserstrahl das Präparat abrastert (engl. to scan: rastern). Bei sogenannten Line Scannern wird dagegen eine ganze Bildzeile auf einmal erstellt, so dass eine höhere Geschwindigkeit erreicht werden kann. Eine dritte Variante benutzt viele Punkte, die jeweils einen Teilbereich des Präparats abrastern, z. B. Spinning Disk Geräte. Alle heutigen Geräte haben die Möglichkeit, Bilder in vielen Schärfeebenen nacheinander aufzunehmen und somit ein dreidimensionales Bild zu erstellen. Jedoch ist diese 3D-Fähigkeit unabhängig vom konfokalen Prinzip, auch gibt es andere Mikroskope, die ebenfalls 3D-Bilder aufnehmen können.

Das Prinzip eines konfokalen Mikroskops wurde von Marvin Minsky in den 1950er Jahren entwickelt, also noch vor der Erfindung des Lasers. Das damalige Funktionsprinzip beruhte auf Hellfeld-Mikroskopie, also auf Weißlicht. Dieser Ansatz ist heute nur noch von historischem Interesse.

Seit 1990 sind verschiedene Weiterentwicklungen des Laser-Scanning-Mikroskops gelungen, die in eigenen Artikeln dargestellt werden und daher hier keine Berücksichtung finden. Dies sind Multiphotonenmikroskop, 4Pi-Mikroskop und STED-Mikroskop.

Punktscanner

Prinzip

Prinzipieller Aufbau eines konfokalen Mikroskops.

In einem normalen Lichtmikroskop ist das Bild eine Überlagerung aus einer scharfen Abbildung der Punkte in der Fokalebene und einer unscharfen Abbildung der Punkte außerhalb dieser. In einem Konfokalmikroskop wird das Anregungslicht in die Probe hineinfokussiert, Licht aus diesem Fokus wird nun in der Regel durch das gleiche Objektiv auf eine Lochblende abgebildet und gelangt von dort auf einen Detektor (meist ein Photomultiplier oder eine Lawinenfotodiode (englisch avalanche photodiode, APD)). Anregungs- und Detektionsfokus liegen konfokal, also übereinander.

Optische Information, die nicht aus der Fokalebene kommt, wird somit zweifach unterdrückt: Erstens wird sie nicht „abgefragt“, da die Beleuchtungsintensität außerhalb des Fokus schwach ist, und zweitens wird Licht von außerhalb der Fokalebene nicht auf die Lochblende fokussiert sondern erscheint dort als Scheibchen, so dass es fast komplett geblockt wird. Dies ist in der Abbildung für einen Punkt hinter der Fokalebene dargestellt (gestrichelte Linie).

Da man lediglich Licht aus einem Punkt der Probe erhält, ist es notwendig die Probe abzurastern und das Bild am Computer zusammenzusetzen.

Wie bei einem Lichtmikroskop begrenzt Beugung die Auflösung. Bei blauem Licht beträgt sie ca. 200 Nanometer lateral und 500 Nanometer axial.

Technische Ausführung

Die meisten Konfokalmikroskope sind Laserrastersondenmikroskope. Bei diesen rastert ein Laserstrahl punktweise ein Objekt, wobei er in der Fokusebene der zu mikroskopierenden Probe maximal fokussiert ist. Es werden nun die Fluoreszenzmoleküle angeregt, die sich im Lichtweg des fokussierten Laserstrahles befinden. Bildet man die Fluoreszenzsignale nun wieder auf einer Bildebene ab, in der sich eine kleine Lochblende befindet, so können nur die Signale, die aus der Fokusebene kommen, exakt in dieses pinhole fallen. Die Signalanteile, die aus anderen Ebenen oberhalb oder unterhalb der Fokusebene in der Probe stammen, werden dadurch ausgeblendet und es kommt zu einer Schichtaufnahme. Hinter der Lochblende befindet sich ein lichtempfindlicher Empfänger, aus dessen Signal dann punktweise ein (Schnitt-)Bild zusammengesetzt wird. Der Durchmesser der Blende bestimmt nun zusammen mit dem Mikroskopobjektiv und dessen numerischer Apertur die Dicke des optischen Schnittes. Die Dicke der abgebildeten Schicht kann bei sehr enger Blende und sehr guten Objektiven auf Werte unter 1 µm eingegrenzt werden. Zeichnet man mehrere Schnitte in verschiedenen Fokusebenen auf, so erhält man eine Schichtung und kann daraus am Computer eine dreidimensionale Rekonstruktion des abgebildeten Objektes erstellen.

Typische Laser-Scanning-Mikroskope sind komplexe Systeme, die aus folgenden Komponenten bestehen:

• einem klassischen Mikroskop
• einem oder mehreren Lasern
• einem Scankopf
• Hardware und Software zur Steuerung der Signalerfassung, -auswertung, -darstellung und -archivierung

Geschichte

Konfokales Weißlichtmikroskop

Das Prinzip eines konfokalen Mikroskops wurde bereits vor der Entwicklung der ersten Laser am 7. November 1957 von Marvin Minsky zum Patent angemeldet^[1]. Verwendet man weißes (d. h. aus unterschiedlichen Wellenlängen bestehendes) Licht anstelle eines Lasers, so werden auch Farbabbildungen mit einem konfokalen Mikroskop möglich. Allerdings lässt sich weißes Licht nicht mit so hohen Intensitäten auf das Objekt fokussieren, wodurch sich die Beobachtungszeiten verlängern. Darum verfügen konfokale Weißlichtmikroskope meist über mehrere parallele Strahlengänge, die eine gleichzeitige Beobachtung mehrerer Stellen auf dem Objekt ermöglichen. Mit geschickten Anordnungen wie einer Nipkow-Scheibe zur Strahlführung ist so eine Abbildung in Echtzeit möglich. Alternativ, aber aufwendiger, kann weißes Licht auch mit einem Pulslaser erzeugt werden: Selbstphasenmodulation

Einzelnachweise

1. ↑ Marvin Minsky: Microscopy Apparatus, US Patent 3.013.467, Eingereicht 7. November 1957, erteilt 19. Dezember 1961.

Siehe auch

• Abtastende Optische Kohärenztomografie

Weblinks

• Optical Microscopy Primer (englisch) Umfangreiche Linksammlung zu detaillierten Beschreibungen der Mikroskopie, u.a. auch virtuelle Konfokalmikroskope
• Poster "Dinoflagellaten unter dem CLSM: Neue Methoden in der Paläontologie" von S.Feist-Burkhardt & J.Pross (PDF-Datei DIN A4, 200KB)