Konfokalmikroskop

Konfokalmikroskop

Ein Konfokalmikroskop ist ein Lichtmikroskop. Im Gegensatz zur normalen konventionellen Lichtmikroskopie wird nicht das gesamte Präparat beleuchtet, sondern zu jedem Zeitpunkt nur ein Bruchteil davon, in den meisten Fällen nur ein beugungsbegrenzter Lichtfleck. Mit diesem kleinen Lichtfleck wird das Präparat Punkt für Punkt abgerastert. Im Mikroskop entsteht also zu keinem Zeitpunkt ein vollständiges Bild. Die Lichtintensitäten des reflektierten oder emittierten Lichtes werden nacheinander an allen Orten des Präparats gemessen, so dass eine anschließende Konstruktion des Bildes möglich ist. Die Besonderheit des Konfokalmikroskops besteht darin, dass im Strahlengang des detektierten Lichts eine Lochblende (englisch: Pinhole) angebracht ist, die Licht, welches von außerhalb der Schärfeebene kommt, blockieren kann. Dadurch verringert sich die Schärfentiefe erheblich, wodurch wiederum die Auflösung entlang der optischen Achse (z-Richtung) steigt.

Heute verbreitete Konfokalmikroskope sind meist konfokale Laser-Scanning-Mikroskope (engl. confocal laser scanning microscope, CLSM, auch LSCM). Diese Geräte benutzen Laserlicht, um Fluoreszenz-Farbstoffe anzuregen, es handelt sich also um Fluoreszenzmikroskope. Weit verbreitet sind Punktscanner, bei denen ein fokussierter Laserstrahl das Präparat abrastert (engl. to scan: rastern). Bei Linienscannern wird dagegen eine ganze Bildzeile auf einmal erstellt, so dass eine höhere Geschwindigkeit erreicht werden kann. Eine dritte Variante benutzt eine Nipkow-Scheibe, auf der mehrere Lochblenden spiralförmig angeordnet sind. Bei der Rotation der Scheibe tastet jede Lochblende eine kreisförmige Trajektorie des Präparats ab. Dieser Mikroskoptyp wird auch als Spinning-Disk-Geräte bezeichnet. Spinning-Disk-Geräte gibt es auch in Ausführungen, die mit Weißlicht funktionieren, sie werden in der Materialprüfung eingesetzt^[1].

Das Prinzip eines konfokalen Mikroskops wurde von Marvin Minsky in den 1950er Jahren entwickelt, also noch vor der Erfindung des Lasers. Das damalige Funktionsprinzip beruhte auf der Fokussierung von Weißlicht auf einen einzelnen Punkt, durch den das Präparat hindurch bewegt wird. Das erste Spinning-Disk-Mikroskop wurde 1967 vorgestellt, es verwendete Weißlicht^[2].

Konfokalmikroskope erlauben durch ihre hohe axiale Auflösung die Aufnahme von vielen Bildern in verschiedenen Schärfeebenen und somit die Erstellung eines scharfen, dreidimensionalen Bilds. Seit 1990 wurden weitere Methoden gefunden, unabhängig vom konfokalen Prinzip 3D-Bilder mit hoher Auflösung aufzunehmen. Dies sind die Multiphotonenmikroskopie, STED-Mikroskopie und Photoactivated Localization Microscopy.

Punktscanner

Prinzip

Prinzipieller Aufbau eines konfokalen Mikroskops.

Verlauf der Helligkeit bei Verschiebung des Fokus durch eine Oberfläche hindurch. Die Halbwertsbreite (FWHM) ist proportional zum Kehrwert der numerischen Apertur zum Quadrat.

In einem normalen Lichtmikroskop ist das Bild eine Überlagerung aus einer scharfen Abbildung der Punkte in der Fokalebene und einer unscharfen Abbildung der Punkte außerhalb dieser. In einem Konfokalmikroskop wird das Anregungslicht in die Probe hineinfokussiert, Licht aus diesem Fokus wird nun in der Regel durch das gleiche Objektiv auf eine Lochblende abgebildet und gelangt von dort auf einen Strahlungsdetektor (meist ein Photomultiplier oder eine Avalanche-Photodiode). Anregungs- und Detektionsfokus liegen konfokal, also übereinander.

Optische Information, die nicht aus der Fokalebene kommt, wird somit zweifach unterdrückt: Erstens wird sie nicht „abgefragt“, da die Beleuchtungsintensität außerhalb des Fokus schwach ist, und zweitens wird Licht von außerhalb der Fokalebene nicht auf die Lochblende fokussiert, sondern erscheint dort als Scheibchen, so dass es fast komplett geblockt wird. Dies ist in der Abbildung für einen Punkt hinter der Fokalebene dargestellt (gestrichelte Linie).

Da man lediglich Licht aus einem Punkt der Probe erhält, ist es notwendig die Probe abzurastern und das Bild am Computer zusammenzusetzen.

Auflösungsvermögen

Wie bei einem Lichtmikroskop begrenzt Beugung die Auflösung. Bei sichtbarem Licht mit einer Wellenlänge von rund 500 Nanometer beträgt sie ca. 200 Nanometer lateral und 500 Nanometer axial. Sie kann mit Hilfe der sogenannten Punktspreizfunktion (engl. „point spread function“ oder PSF) experimentell oder theoretisch^[3] bestimmt werden. Bei der konventionellen sogenannten Weitfeld-Mikroskopie (engl. wide-field microscopy) wird die Probe großflächig beleuchtet und mittels des Objektives abgebildet, so dass die PSF des Gesamtsystems nur durch die (Detektions-)PSF des Objektivs bestimmt ist. Im Gegensatz dazu wird das einfallende Licht bei einem konfokalen Mikroskop auf die Probe fokussiert, so dass in diesem Fall die Gesamt-PSF das Produkt der Beleuchtungs-PSF und der Detektions-PSF ist. Dies führt zu einer im Vergleich zur Weitfeld-Mikroskopie (Rayleigh-Kriterium: d = 0,61λ / NA) um ungefähr 30 % verbesserten beugungsbedingten Auflösung: d = 0,4λ / NA^[4][5].

Verwendet man das Konfokalmikroskop nicht zur Volumenabbildung wie in den Lebenswissenschaften sondern, wie in der Materialforschung, zur geometrischen Vermessung einer Oberfläche, so ist die Tiefenauflösung nicht durch die optische Auflösung begrenzt. Der beschränkende Faktor ist die Unsicherheit mit der die Position der maximalen Intensität entlang der optischen Achse bestimmt werden kann. Die Unsicherheit ist in erster Linie durch das Systemrauschen beschränkt^[6] und beträgt in einem gut aufgebauten Konfokalmikroskop bei Verwendung eines hochaperturigen Objektivs nur wenige Nanometer.

Technische Ausführung

Die meisten Konfokalmikroskope sind Laserrastersondenmikroskope. Bei diesen rastert ein Laserstrahl punktweise ein Objekt, wobei er in der Fokusebene der zu mikroskopierenden Probe maximal fokussiert ist. Es werden nun die Fluoreszenzmoleküle angeregt, die sich im Lichtweg des fokussierten Laserstrahles befinden. Bildet man die Fluoreszenzsignale nun wieder auf einer Bildebene ab, in der sich eine kleine Lochblende befindet, so können nur die Signale, die aus der Fokusebene kommen, exakt in dieses pinhole fallen. Die Signalanteile, die aus anderen Ebenen oberhalb oder unterhalb der Fokusebene in der Probe stammen, werden dadurch ausgeblendet und es kommt zu einer Schichtaufnahme. Hinter der Lochblende befindet sich ein lichtempfindlicher Empfänger, aus dessen Signal dann punktweise ein (Schnitt-)Bild zusammengesetzt wird. Der Durchmesser der Blende bestimmt nun zusammen mit dem Mikroskopobjektiv und dessen numerischer Apertur die Dicke des optischen Schnittes. Die Dicke der abgebildeten Schicht kann bei sehr enger Blende und sehr guten Objektiven auf Werte unter 1 µm eingegrenzt werden. Zeichnet man mehrere Schnitte in verschiedenen Fokusebenen auf, so erhält man eine Schichtung und kann daraus am Computer eine dreidimensionale Rekonstruktion des abgebildeten Objektes erstellen.

Typische Laser-Scanning-Mikroskope sind komplexe Systeme, die aus folgenden Komponenten bestehen:

• einem klassischen Mikroskop
• einem oder mehreren Lasern
• einem Scankopf
• Hardware und Software zur Steuerung der Signalerfassung, -auswertung, -darstellung und -archivierung

Geschichte

Konfokales Weißlichtmikroskop

3d-Profil einer 1-Euro-Münze (Ausschnitt), gemessen mit einem konfokalen Weißlichtmikroskop

Ein frühes, nicht abbildendes, Konfokalmikroskop beschrieb H. Naora^[7] bereits 1951. Er verwendete es für die Spektroskopie von Nukleinsäuren.

Das Prinzip eines abbildenden konfokalen Mikroskops wurde noch vor der Entwicklung des ersten Lasers am 7. November 1957 von Marvin Minsky zum Patent angemeldet^[8]. Verwendet man weißes (d. h. aus unterschiedlichen Wellenlängen bestehendes) Licht anstelle eines Lasers, so werden auch Farbabbildungen mit einem konfokalen Mikroskop möglich. Allerdings lässt sich weißes Licht nicht mit so hohen Intensitäten auf das Objekt fokussieren, wodurch sich die Beobachtungszeiten verlängern. Darum verfügen konfokale Weißlichtmikroskope meist über mehrere parallele Strahlengänge, die eine gleichzeitige Beobachtung mehrerer Stellen auf dem Objekt ermöglichen. Mit geschickten Anordnungen wie einer Nipkow-Scheibe zur Strahlführung ist so eine Abbildung in Echtzeit möglich. Alternativ, aber aufwendiger, kann weißes Licht auch mit einem Pulslaser erzeugt werden: Selbstphasenmodulation

Einzelnachweise

1. ↑ Heike Schmidt, Jürgen Valentin: Konfokal messen - 3D Oberflächenmessung per Mikroskop. Praxis Profiline November 2006. pdf
2. ↑ Egger MD, Petrăn M: New reflected-light microscope for viewing unstained brain and ganglion cells. In: Science (New York, N.Y.). 157, Nr. 786, Juli 1967, S. 305–7. doi:10.1126/science.157.3786.305. PMID 6030094.
3. ↑ Nasse M. J., Woehl J. C.: Realistic modeling of the illumination point spread function in confocal scanning optical microscopy. In: J. Opt. Soc. Am. A. 27, Nr. 2, 2010, S. 295–302. doi:10.1364/JOSAA.27.000295.
4. ↑ Handbook of biological Confocal Microscopy, 3rd ed., New York: Springer-Verlag June 2006, ISBN 978-0-387-25921-5
5. ↑ Kenneth R. Spring, Thomas J. Fellers, Michael W. Davidson: Theory of Confocal Microscopy - Resolution and Contrast in Confocal Microscopy. Abgerufen am 25. April 2010.
6. ↑ VDI/VDE 2655-1.2: Optische Messtechnik an Mikrotopografien; Kalibrieren von konfokalen Mikroskopen und Tiefeneinstellnormalen für die Rauheitsmessung. Inhalt-Entwurf
7. ↑ H. Naora, Microspectrophotometry and cytochemical analysis of nucleic acids, Science 14, Band. 114, Nr. 2959, S. 279--280, 1951.
8. ↑ Marvin Minsky: Microscopy Apparatus, US Patent 3.013.467, Eingereicht 7. November 1957, erteilt 19. Dezember 1961.

Siehe auch

 Commons: Bilder zur Funktionsweise der Konfokalmikroskopie – Album mit Bildern und/oder Videos und Audiodateien

 Commons: Medien mit Bildern, die mit konfokalen Mikroskopen aufgenommen wurden – Sammlung von Bildern, Videos und Audiodateien

• Konfokaltechnik
• Abtastende Optische Kohärenztomografie
• Chromatisch-konfokale Abstandsmessung

Weblinks

• Optical Microscopy Primer (englisch) Umfangreiche Linksammlung zu detaillierten Beschreibungen der Mikroskopie, u.a. auch virtuelle Konfokalmikroskope
• Poster "Dinoflagellaten unter dem CLSM: Neue Methoden in der Paläontologie" von S.Feist-Burkhardt & J.Pross (PDF-Datei DIN A4, 200KB)
• Die konfokale Laser Scanning Mikroskopie Einführung in die konfokale Mikroskopie von Zeiss (PDF-Datei, 884 KB)