Logit-Log-Plot

Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (EIA) bzw. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) bezeichnet ein immunologisches Nachweisverfahren (Assay), das im Gegensatz zum Radioimmunoassay (RIA) nicht auf einer Radioaktivitätsmessung sondern auf einer enzymatischen Farbreaktion basiert. Wie der Radioimmunoassay gehört auch der ELISA zur Gruppe der Immunassay-Verfahren.

Typischer ELISA („Anti human IgG“ Double Antibody Sandwich)

Mit Hilfe des ELISA können Proteine, Viren aber auch niedermolekulare Verbindungen wie Hormone, Toxine und Pestizide in einer Probe (Blutserum, Milch, Urin, etc.) nachgewiesen werden. Hierbei macht man sich die Eigenschaft spezifischer Antikörper zu Nutze, die an den nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Antikörper oder Antigen werden zuvor mit einem Enzym markiert. Die durch das Enzym katalysierte Reaktion dient als Nachweis für das Vorhandensein des Antigens. Das sog. Substrat wird vom Enzym umgesetzt, das Reaktionsprodukt kann üblicherweise durch Farbumschlag, Fluoreszenz oder Chemolumineszenz nachgewiesen werden. Die Signalstärke ist im allgemeinen eine Funktion der Antigenkonzentration, so dass ELISA auch für quantitative Nachweise verwendet werden kann.

Double-Antibody-Sandwich-ELISA

Sandwich ELISA. (1) Mit coating-Antikörper beschichtete Mikrotiterplatte; (2) Zugabe der Probe und Inkubation; (3) Zugabe des Detektions--Antikörpers; (4) Zugabe und Komplexbildung des enzyme-linked Antikörper - Antigen - Antikörper; (5) Zugabe eines zum Enzym passenden Substrats, das zu einem nachweisbaren Reaktionsprodukt umgesetzt wird.

Eine der ELISA Techniken (Sandwich-ELISA) verwendet zwei Antikörper (Ak), die beide spezifisch an das nachzuweisende Antigen binden. Hierbei ist es wichtig, dass beide Antikörper an unterschiedlichen Stellen an das Antigen binden, da sie sich sonst gegenseitig behindern würden. Der erste Antikörper (coating-Antikörper) wird an eine feste Phase (meist spezielle 96-Well-Mikrotiterplatte) gebunden. Die Probe mit dem nachzuweisenden Antigen wird dann in die wells gegeben und eine Zeit lang inkubiert. Während dieser Zeit bindet der an die Platte gebundene Antikörper das in der Probe vorhandene Antigen. Nach Ablauf der Inkubationsphase wird die Platte gewaschen. Die ungebundenen Bestandteile der Probe werden dadurch entfernt und zurück bleibt nur das am (coating-) Antikörper gebundene Antigen. Im nächsten Schritt wird ein Detektions-(detection)-Antikörper zugegeben, an dessen Ende ein Enzym (meistens Meerrettichperoxidase (HRP, von engl. horseradish), Alkalische Phosphatase (AP) oder seltener Glucoseoxidase (GOX)) gebunden ist. Dieser zweite Antikörper bindet ebenfalls an das Antigen und es entsteht der Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex (deshalb der Name Sandwich-ELISA - das Antigen ist zwischen die beiden Antikörper wie in einem Sandwich gepackt). Durch erneutes Waschen der Platte wird der überschüssige zweite Antikörper ausgewaschen und dann ein zum Enzym passendes chromogenes Substrat zugegeben. Dieses wird vom Enzym zu einem Reaktionsprodukt umgesetzt, dessen Nachweis durch Farbumschlag, Fluoreszenz oder Chemoluminiszenz erfolgen kann. Für quantitative Nachweise wird üblicherweise eine Serie mit bekannten Antigenkonzentrationen durchgeführt, um eine Kalibrierungskurve für das gemessene Signal (optische Extinktion, emittierte Intensität) zu erhalten. Alternativ kann auch die Kombination eines ungekoppelten Detektions-Antikörpers und eines zusätzlichen sekundären Antikörpers, an den ein Enzym gebunden wurde, verwendet werden (s. Abb.). Obwohl aufwändiger hat die Verwendung eines sekundären Antikörperkonjugats den Vorteil, dass die (teure) Herstellung Enzym-gekoppelter Primärantikörper, die nur für jeweils ein Antigen spezifisch sind, umgangen werden kann. Sekundäre Enzym-gekoppelte Antikörper, die universell die Fc-Region anderer Antikörper erkennen, können so für eine Vielzahl unterschiedlicher Immunassays verwendet werden.

Im Falle von alkalischer Phosphatase wird als Chromogen z.B. p-Nitrophenylphosphat (pNPP) zugegeben. Die alkalische Phosphatase spaltet den Phosphatrest vom farblosen Nitrophenylphosphat ab und es entsteht p-Nitrophenol, welches schwach gelb ist. Diese Reaktion kann in einem Photometer verfolgt werden. Die Intensität der Farbe ist dabei proportional zu der Konzentration des entstandenen Nitrophenols und damit auch der Konzentration des zu bestimmenden Antigens in der Probe.

Kompetitiver Immunoassay

Häufig wird jedoch auch der kompetitive Immunoassay angewendet. Hierbei wird kein markierter Antikörper verwendet, sondern ein markiertes Kompetitor-Antigen (eine synthetische Verbindung, die dem Analyten strukturell ähnlich ist und auch am Antikörper bindet) eingesetzt. So kommt es zur Kompetition (Konkurrenz) zwischen Analyt und Kompetitor um einen Bindungsplatz am Antikörper. Das Signal ist hier indirekt und nicht direkt proportional zur Analyt-Konzentration.

Auswertung des ELISAs mit Hilfe des Logit-Log-Plot

Logit-Funktion

Eine sigmoide Kurvenform tritt dann auf, wenn man auf der x-Achse den natürlichen Logarithmus der Konzentration und auf der y-Achse die Extinktion (=OD=optische Dichte=Absorption) aufträgt. Diese Darstellungsform ist das halb-logarithmische Diagramm.

Um eine lineare Regression berechnen zu können, muss man diese Sigmoide vorher linearisieren. Zu diesem Zweck behält man die Dimension der x-Achse bei und rechnet die y-Achse in Logit-Werte um. Dabei sollte eine gerade Linie entstehen. Diese Darstellungsform wird Log-Logit-Plot, Logit-Log-Plot oder auch Logit-Plot genannt.

Um Logit-Werte aus den Extinktionswerten berechnen zu können, muss man zuerst die Extinktionswerte (w) normalisieren (n), so dass sie einen Bereich von 0 bis 1 abdecken. Dazu benötigt man die untere (u) und die obere (o) Asymptote der sigmoiden Kurve.

$n=\frac{w-u}{o-u}$

Umkehrfunktion:

$w=u+n\cdot(o-u)$

Diese normalisierten Extinktionswerte (n) gehen dann in die Logit-Gleichung ein (L):

$L=\ln\left(\frac{n}{1-n}\right)$

Umkehrfunktion:

$n=\frac{e^L}{1+e^L}$

Die Wertepaare des Logit-Log-Plots aus dem x-Wert = natürlicher Logarithmus der Konzentration, und dem y-Wert = Logit der normalisierten Extinktionswerte (L) gehen dann in die Berechnung der linearen Regression ein. Diese liefert dann die Höhe (a) und die Steigung (b) der Geradengleichung:

$y=a+b\cdot x$

Umkehrfunktion:

$x=\frac{y-a}{b}$

Für die Interpolation von unbekannten Messwerten auf die so erstellte Kalibrationskurve, fälschlich auch oft als Eichkurve bezeichnet, benötigt man dann die Umkehrfunktionen. Die höchste Genauigkeit wird in der Nähe des in der Mitte der Sigmoiden liegenden Wendepunktes erreicht, weil an dieser Stelle ihre Steigung am größten ist. Die geringste Genauigkeit entsteht in der Nähe ihrer Asymptoten.

Falls man aus mehreren unterschiedlichen Messwerten mit Hilfe der Asymptoten der Kalibrationskurve eine Messkurve errechnen kann, dann ist es am genauesten, wenn man die Wendepunktskonzentration der Kalibrationskurve mit der Wendepunktsverdünnung der Messkurve vergleicht. Die Asymptoten der Messkurven werden ignoriert, weil man alle Messergebnisse auf den Wendepunkt der Kalibrationskurve beziehen muss, der bei den y-Werten n = 0,5 im halblogarithmischen Diagramm, identisch mit L = 0 im Logit-Log-Plot, zu finden ist. Bei der halblogarithmischen Darstellung der Messkurve dient der natürliche Logarithmus des Kehrwertes der Verdünnung als x-Achse, weil bei den Messwerten die Konzentration vor der Berechnung noch unbekannt ist.

Grundsätzlich ist es auch möglich, anstelle der natürlichen Logarithmen ln die dekadischen Logarithmen oder jene mit der Basis von 2 zu verwenden. Anstelle des Kehrwertes der Verdünnung kann auch nur die Verdünnung (Dilution) selbst eingesetzt werden. Es ist zudem zulässig, den Wert von n als von 0 bis 100 Prozent gehend zu berechnen, sofern man die Gleichungen korrekt modifiziert. Nicht richtig wäre es aber, den Logit direkt aus den nicht normalisierten Extinktionswerten w zu berechnen.

Literatur

• Engvall, E. & Perlman, P. (1971): Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. In: Immunochemistry. Bd. 8, S. 871-874. PMID 5135623
• Goldsby, R.A., Kindt, T.J., Osborne, B.A. & Kuby, J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. In: Immunology, 5th ed., pp. 148-150. W. H. Freeman, New York, 2003, ISBN 0-7167-4947-5

Siehe auch

• Virologische Diagnostik
• ELISPOT
• Schwangerschaftstest

Weblinks

• Eine animierte Illustration des ELISA-Prozesses
• englischsprachige Animation, direkter und indirekter ELISA-Prozess