- Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
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Die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist die Kombination von zwei Methoden der Molekularbiologie – die Nutzung der Reversen Transkriptase (RT) und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – um die Genexpression von spezifischen Genen in Zellen, Geweben oder Blutserum nachzuweisen. Verwendet wird die RT-PCR in Forschung und Diagnostik.
Die Technik
Um die Transkription eines Genes nachzuweisen, muss die abgelesene RNA untersucht werden. Bei der Amplifikation von DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden spezifische DNA-Polymerasen verwendet, die DNA-abhängig sind, d. h. sie sind nicht in der Lage, RNA zu amplifizieren. Daher wird zuerst eine Reverse Transkriptase (RT) eingesetzt, eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, mit deren Hilfe RNA in cDNA umgeschrieben werden kann. Die cDNA kann im Anschluss als Ausgangsmaterial in einer PCR verwendet werden, um spezifische Sequenzen aus dieser zu amplifizieren.
Die Produkte der RT-PCR lassen sich gelelektrophoretisch untersuchen und/oder anschließend klonieren.
Die heute eingesetzten Reversen Transkriptasen sind veränderte Enzymvarianten aus unterschiedlichen Retroviren, wie das Murine Leukemia Virus (MLV) oder das Avian Myeloblastosis Virus (AMV). Die verschiedenen Varianten des Enzyms sind je nach Hersteller derart modifiziert worden, dass sie höhere Spezifität oder bessere Erträge generieren können, beispielsweise wird die im Enzym intrinsisch vorkommende RNase H-Aktivität deletiert.
Wie andere DNA-Polymerasen benötigt auch eine Reverse Transkriptase ein kurzes DNA-Stück, einen so genannten Primer, zur Initiation der DNA-Synthese. Oftmals wird hier ein so genannter Oligo-d(T)-Primer verwendet, also mehrere Thymin-Basen, welche komplementär zum Poly(A)-Schwanz am 3'-Ende der mRNA sind. Erst im zweiten Schritt der RT-PCR werden dann Gen-spezifische Primer eingesetzt. Bei einer modifizierten Variante, die One-Step RT-PCR, werden statt dessen direkt Gen-spezifische Primer verwendet und beide Reaktionen werden hintereinander im selben Gefäß ausgeführt. Eine weitere Variante der RT-PCR ist die RACE-PCR.
Die Abkürzung RT-PCR bezeichnet gelegentlich auch die Real time quantitative PCR, was zu Verwechslungen führen kann. Diese sollte mit RT-qPCR oder qRT-PCR abgekürzt werden.
Das Ergebnis
Da eine cDNA zur ursprünglichen mRNA komplementär ist, kann aus dieser anhand des genetischen Codes auch die Aminosäurensequenz eines Proteins abgeleitet werden, für welches diese mRNA kodiert. Da eine mRNA in Eukaryoten nach ihrer Transkription bereits modifiziert und gespleißt wurde, ist sie im Gegensatz zum Gen auch Intron-frei. Darüber hinaus ermöglicht diese cDNA auch Informationen darüber zu erhalten, ob das dazugehörige Gen in verschiedenen Isoformen exprimiert wird, d. h. die mRNA alternativ gespleißt wird. Über RT-PCR lässt sich also gezielt Genexpression nachweisen. Genutzt wird die RT-PCR auch bei der Diagnose von RNA-Viren im Blutserum, wie HIV und in jüngerer Zeit häufig auch im Zusammenhang mit Influenza A/H5N1.
Siehe auch
Kategorien:- Molekularbiologie
- Biologische Untersuchungsmethode
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