iTRAQ

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Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) ist eine gel-freie Methode um Proteine verschiedener Quellen in einem Experiment gemeinsam zu quantifizieren.^[1][2][3]

Verfahren

Diese Methode basiert auf dem kovalenten Markieren des N-Terminus und der Amino-Seitenketten der Peptide mit Tags verschiedener Massen. Derzeit werden zwei verschiedene Reagenzien verwendet: 4-plex and 8-plex, welche dazu verwendet werden können, alle Peptide verschiedenster Herkunft zu markieren. Diese Proben werden dann gepoolt und üblicherweise per nano Flüssigchromatografie fraktioniert und anschließend mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) analyisiet. Danach wird eine Datenbanksuche mit den Fragmentierungsdaten ausgeführt, um die markierten Peptide zu identifizieren und so die entsprechenden Proteine zu bestimmen. Die Fragmentierung der Tags erzeugt im unteren Massenbereich je Tag-Typ ein Reporter-Ion, dessen Abundanz dazu verwendet werden kann, im gleichen Spektrum die Peptide (und damit die Proteine) relativ zueinander zu quantifizieren.

Datenauswertung

Peptid-Ebene

Die Signale der Reporter-Ionen in jedem MS/MS-Spektrum erlauben es, die relative Abundanz (Ratio) der Peptide zu berechnen, die über dieses Spektrums identifiziert wurden. Aufgrund von Messungenauigkeiten kann es durchaus auftreten, dass die Reporter-Ionen durch jeweils mehr als ein Signal im Spektrum vertreten sind und diese auf geeignete Weise und ohne Informationsverfälschung zu einem Peak zusammengefasst werden müssen. Hier einfach die Fläche zu integrieren verfälscht das Ergebnis der Quantifizerung ungemein und führt zu gravierenden Fehlern in der Quantifizierung.^[4] Die Intensitäten dieser Signale müssen aufaddiert werden, allein deswegen weil das Instrument selbst schon ein Binning vornimmt und jedes im Detektor erkannte Ion von ihm gezählt wird. Zudem ist ein MS/MS-Spektrum ein Histogramm und repräsentiert keine stetige Kurve, weswegen sich schon allein deswegen die Berechnung einer Fläche verbietet.

Protein-Ebene

Die Ratios der Peptide sind log-normal verteilt.^[5] Daher repräsentiert der Median der Peptid-Ratios eines Proteins die relative Quantifizierung dieses Proteins.^[6]

Software

Die Daten der MS/MS-Spektren können mit folgender frei verfügbarer Software analysiert werden

• i-Tracker^[7], ein einfaches Programm, das um die Peaks eine Fläche berechnet und diese zur Bestimmung der Ratios verwendet.
• Quant, ein Matlab-Skript, das den statistisch päzisen Algorithmus implementiert ^[8]
• Quant for windows ^[9], die Windows Implementierung von Quant
• jTraqX ^[10], die portable Java Implementierung von Quant

Einzelnachweise

1. ↑ Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ: Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. In: Mol. Cell. Proteomics. 3, Nr. 12, 2004, S. 1154–69. doi:10.1074/mcp.M400129-MCP200. PMID 15385600.
2. ↑ Zieske LR: A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies. In: J. Exp. Bot.. 57, Nr. 7, 2006, S. 1501–8. doi:10.1093/jxb/erj168. PMID 16574745.
3. ↑ Gafken PR, Lampe PD: Methodologies for characterizing phosphoproteins by mass spectrometry. In: Cell Commun. Adhes.. 13, Nr. 5–6, 2006, S. 249–62. doi:10.1080/15419060601077917. PMID 17162667. Volltext bei PMC: 2185548.
4. ↑ Boehm, A. M., Puetz, S., Altenhofer, D., Sickmann, A., Falk, M., Precise protein quantification based on peptide quantification using iTRAQ, BMC Bioinformatics, 2007, 8:214, doi:10.1186/1471-2105-8-214
5. ↑ Boehm, A. M., Puetz, S., Altenhofer, D., Sickmann, A., Falk, M., Precise protein quantification based on peptide quantification using iTRAQ, BMC Bioinformatics, 2007, 8:214, doi:10.1186/1471-2105-8-214
6. ↑ Boehm, A. M., Puetz, S., Altenhofer, D., Sickmann, A., Falk, M., Precise protein quantification based on peptide quantification using iTRAQ, BMC Bioinformatics, 2007, 8:214, doi:10.1186/1471-2105-8-214
7. ↑ Shadforth IP, Dunnley PJ, Lilley KS, Bessant C: i-Tracker: For quantitative proteomics using iTRAQ. In: BMC Genomics. 6, 2005, S. 145. doi:10.1186/1471-2164-6-145. PMID 16242023. Volltext bei PMC: 1276793.
8. ↑ Boehm, A. M., Puetz, S., Altenhofer, D., Sickmann, A., Falk, M., Precise protein quantification based on peptide quantification using iTRAQ, BMC Bioinformatics, 2007, 8:214, doi:10.1186/1471-2105-8-214
9. ↑ Boehm, A. M., Altenhöfer, D., Pütz, S., Precise and Statistically Sound Protein Quantification in Mass Spectrometry Based Proteomics Using iTRAQ, in: Küng, J., Schneider, K., Wagner, R., 2nd International Conference on Bioinformatics Research and Development (BIRD'08), Schriftenreihe Informatik, 26, Trauner Verlag, Linz, 2008: 3-12
10. ↑ Muth, T., Keller, D., Puetz, S. M., Martens, L., Sickmann, A., Boehm, A. M., jTraqX: a Free, Platform Independent Tool for Isobaric Tag Quantitation at the Protein Level, Proteomics, 2010, 10(6): 1223-1225, doi:10.1002/pmic.200900374

Weblinks

• Tools für Protein-Massenspektrometrie
• Centre for Proteome Research