Durchflusscytometrie

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Beispiel für die Anwendung der Durchflusszytometrie

Der Begriff Durchflusszytometrie beschreibt ein Verfahren, das in der Biologie und in der Medizin zur Anwendung kommt.

Historie

Die heutzutage verwendete Schlüsseltechnologie der fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie wurde 1968 an der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster von Göhde entwickelt (Patent DE1815352). Das weltweit erste kommerziell erhältliche Durchflusszytometer war das ICP 11 des deutschen Entwicklers und Herstellers Partec (lizenziert an die Phywe AG Göttingen), gefolgt vom Cytofluorograph (Bio/Physics Systems 1971). Zuerst wurde diese Technik für eukaryotische Zellen verwendet, kann aber auch für die Analyse von Bakterien hinsichtlich ihres metabolischen Status, ob sie lebend oder tot sind oder einfach nur um die Zellzahl zu bestimmen verwendet werden.

Begriffsklärung

Das Akronym FACS (=fluorescence activated cell sorting), welches häufig synonym zu Durchflusszytometrie verwendet wird, ist eine geschützte Handelsmarke der Firma Becton Dickinson (BD). Neben BD gibt es jedoch eine Vielzahl anderer Hersteller von Geräten oder Reagenzien für die Durchflusszytometrie. Zudem ist das Akronym eigentlich irreführend, da meist keine Sortierung, sondern nur eine Messung der Eigenschaften von Zellen vorgenommen wird.

Prinzip

Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen Laserstrahl passiert. Hierbei werden die in einer Lösung befindlichen Zellen durch eine Kapillare gesaugt und passieren im Sensormodul einzeln einen Laserstrahl. Die Zellen streuen einen Teil des Lichts, welches mittels Detektoren (Photomultiplier) nachgewiesen wird. Die Menge des gestreuten Lichts korreliert mit der Größe der Zelle und mit ihrer Komplexität. So streuen Granulozyten, die eine raue Oberfläche und in ihrem Inneren viele Vesikel haben, deutlich mehr Licht als die sehr glatten T-Zellen. Das Vorwärtsstreulicht (FSC = Forward Scatter) ist ein Maß für die Beugung des Lichts im flachen Winkel und hängt vom Volumen der Zelle ab. Das Seitwärtsstreulicht (SSC = Sidewards Scatter) ist ein Maß für die Brechung des Lichts im rechten Winkel, die von der Granularität der Zelle, der Größe und Struktur ihres Zellkerns und der Menge der Vesikel in einer Zelle beeinflusst wird. Mit diesen beiden Parametern lassen sich zum Beispiel die Zellen des Blutes bereits recht gut unterscheiden.

Fluoreszenzmessungen

Zugleich mit dem gestreuten Licht kann man im Durchflusszytometer Fluoreszenzfarben messen. Nur wenige Zellen emittieren per se fluoreszierendes Licht. Daher verwendet man Farbstoffe, die an bestimmte Bestandteile der Zellen binden. Setzt man z.B. die Farbstoffe DAPI und Propidiumiodid ein, welche in die DNA einer Zelle interkalieren (d.h. sich zwischen die Basen einlagern), kann man anhand der Helligkeit der Zelle untersuchen, wie viel DNA sie enthält. Auch Antikörper, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, können verwendet werden. Die Antikörper sind meist gegen bestimmte Oberflächenproteine (z.B. Proteine der CD-Klassifizierung; CD = Cluster of differentiation) gerichtet. Nach Markierung kann dann auch die Sortierung nach diesen Merkmalen erfolgen. Durch Einsatz von verschiedenfarbigen Lasern und vor allem Filtern kann die Anzahl der einsetzbaren Farbstoffe und damit die Informationsdichte erhöht werden.

Aufbau eines Durchflusszytometers

Das Durchflusszytometer besteht aus:

• Der Durchflusszelle. Durch diese Zelle wird die Zellsuspension in einem sehr dünnen Strahl geleitet. Hier findet die Messung statt.
• Der Lichtquelle. Meist mehrere Laser, aber auch Xenon- oder Argonlampen können verwendet werden.
• Den Filtern zur Auftrennung der Fluoreszenzsignale auf verschiedene Detektoren.
• Den Detektoren. In der Regel werden Photomultiplier verwendet, um die eingehenden Signale zu verstärken. Die Messung kann linear oder logarithmisch erfolgen.
• Dem Computer.

High-Throughput

Das optische Prinzip des Durchflusszytometers ähnelt sehr stark dem des (Fluoreszenz-)Mikroskops. Im Gegensatz zum Mikroskop kann man im Durchflusszytometer bis zu 1000 Zellen pro Sekunde typisieren. Die Kontrolle der Messung ist in Echtzeit möglich.

Die im Durchflusszytometer gesammelten Daten werden in Graphen dargestellt, in denen ein oder zwei Parameter zugleich betrachtet werden. Eine Teilmenge der Zellen, die innerhalb einer frei wählbaren Region liegen, können mit Hilfe eines sogenannten „Gates“ für weitere Analysen ausgewählt werden. Durch Sequenzen von sequentiellen Gates können detaillierte Analysen gemacht werden.

Anwendung

Die Durchflusszytometrie wird in der Klinik für die Routinediagnostik unter anderem in der Hämatologie, Infektiologie und Immunologie eingesetzt. Ein weiteres großes Einsatzgebiet der Durchflusszytometrie stellt die medizinische und zellbiologische Grundlagenforschung dar. Außerdem wird dieses Verfahren auch in der Biotechnologie verwendet, z.B. um Spermazellen mit dem Geschlechtschromosom X und solche mit dem Chromosom Y voneinander zu trennen (wobei dazu auch die Dichtegradientenzentrifugation geeignet ist). Somit kann man das Geschlecht eines durch In-vitro Fertilisation erzeugten Embryos bestimmen, indem vor der In-vitro-Fertilisation die Spermien mit einem X und einem Y-Chromosom getrennt werden. Eine weitere Anwendung ist in der Biologie die quantitative Untersuchung von Bakterienzellen. Neben der einfachen Bestimmung der Zellzahlen, durch Anfärben der Zellen zumeist mit dem fluoreszierenden DNA-Farbstoff SYBR Green I, können lebende von toten Zellen unterschieden werden. Propidiumiodid gelangt nur in Zellen mit nicht mehr intakter Zellmembran und färbt somit nur tote Zellen. In Kombination mit einem DNA-Farbstoff kann der Anteil der toten Zellen von der Gesamtzellzahl bestimmt werden.

Quellen

• Application note von BD: Bacterial Detection and Live/Dead Discrimination by Flow Cytometry

Nebe-von-Caron G., Stephens P.J., Hewitt C.J., Powell J.R., Badley R.A.: "Analysis of bacterial function by multi-colour fluorescence flow cytometry and single cell sorting. Journal of Microbiolgical Methods. 2000;42:97-114