Random priming

Random priming

Als Random priming (oder auch random-primed oligo-labeling) wird in der Molekularbiologie eine Technik zur Markierung von DNA bezeichnet. Dabei synthetisiert man an denaturierte (einzelsträngige) DNA mit Hilfe von kurzen Primern als Startpunkt einen markierten Gegenstrang.

Zu Beginn wird die zu markierende DNA denaturiert. Danach wird ein Gemisch aus Oligonukleotiden, meist Hexaoligonukleotide, seltener auch etwas längere, mit zufälliger Sequenz hinzugegeben und diese in einer als annealing bezeichneten Phase an den Gegenstrang angelagert. Das als Klenow-Enzym bezeichnete Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli nutzt diese Primer, um den Gegenstrang mit Hilfe markierter Nukleotide zu synthetisieren. Man benutzt das Klenow-Fragment, da dieses zwar von 5' nach 3' synthetisieren (Polymerase-Aktivität) und von 3' nach 5' Nukleotide herausschneiden kann (Exonuklease-Aktivität), jedoch nicht von 5' nach 3' schneidet. Dadurch stoppt das Klenow-Enzym, wenn es auf den nächsten Primer stößt, der durchschnittlich nach 500 bis 2000 Basen (je nach Primer) kommt.

Die Markierung der DNA kann wie bei der Nick translation dadurch erfolgen, dass radioaktiv markierte oder mit einem Markierungs-Molekül (Digoxygenin, Biotin, Fluoreszenzfarbstoff) verknüpfte Nukleotide eingesetzt werden. Durch die nur kurzen zu synthetierenden Stränge ist dieses System sehr einfach und schnell.

Literatur

  • A. P. Feinberg & B. Vogelstein (1983): A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. In: Anal. Biochem. Bd. 132, S. 6–13. PMID 6312838

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