Single Plane Illumination Microscopy

Prinzip eines Single Plane Illumination-Mikroskops

Thermische Bewegung von fluoreszierenden Latex-Kügelchen (Durchmesser etwa 20 nm) in Wasser, aufgenommen mit einem SPIM

Bei der Single Plane Illumination Microscopy oder Selective Plane Illumination Microscopy (kurz: SPIM) – auf Deutsch auch Lichtscheiben-Mikroskopie^[1] bzw. Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie^[2] – handelt es sich um ein modernes fluoreszenz-mikroskopisches Verfahren mittlerer Auflösung. Dabei wird nur eine Ebene in der Probe (typischerweise einige Mikrometer dick) mit Anregungslicht beleuchtet, sodass negative Effekte durch Bleichen oder lichtinduzierten Stress in biologischen Proben vermindert werden.

Aufbau eines SPI-Mikroskops

Bei dieser Art der Mikroskopie^[3] wird senkrecht zur Beobachtungsrichtung Anregungslicht eingestrahlt (typischerweise durch einen Laser, der auf die Absorptionsbanden des gewählten Fluoreszenzfarbstoffes abgestimmt ist). Der Laserstrahl wird zunächst mit Hilfe einer Blende auf ein rechteckiges Profil gebracht, das dann mit Hilfe einer Zylinderlinse nur in einer Richtung fokussiert wird. So ergibt sich eine „Lichtscheibe“, die nur eine dünne Schicht innerhalb der Probe ausleuchtet. Fluoreszenzfarbstoffmoleküle in dieser Schicht werden zur Fluoreszenz angeregt, welche dann senkrecht dazu mit Hilfe eines Standard-Mikroskopieobjektivs beobachtet wird. Um genug Platz für die Projektion der Lichtscheibe zu haben, werden üblicherweise sog. Tauchobjektive mit großem Arbeitsabstand (2–3 mm) eingesetzt, die vollständig in Wasser, bzw. eine Pufferlösung eintauchen. Daher wird um die Probe eine wassergefüllte Probenkammer konstruiert, die es auch erlaubt, die Probe bei physiologischen Bedingungen zu untersuchen (z.B. physiologische Salzkonzentrationen und 37 °C).

Das fokussieren unterschiedlicher Teile der Probe erfolgt hier (im Gegensatz zur Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie) typischerweise nicht durch verschieben des Detektionsobjektives, da dann auch die Position der Lichtscheibe entsprechend geändert werden müsste, sondern durch das Verschieben der Probe selbst.

Auflösungsvermögen

Die Beobachtung erfolgt bei SPIM über Mikroskopobjektiv, welches in eine wassergefüllte Probenkammer eintaucht und die Probe direkt abbildet. Damit ist die laterale Auflösung vollständig durch dieses Objektiv gegeben und erreicht maximal etwa eine halbe bis eine Wellenlängen (also z.B. bei grüner Fluoreszenz etwa 250–500 nm)^[3]. Die longitudinale Auflösung ist deutlich schlechter (typischerweise mehr als einen Faktor 4). Sie kann aber etwas verbessert werden, indem das Lichtblatt dünner gemacht wird, sodass nur in einem Teil des Beobachtungsfokus Fluoreszenz angeregt wird. Idealerweise wird so die longitudinale Auflösung gleich der lateralen.

Anwendung

SPIM wird oft in der Entwicklungsbiologie eingesetzt, wo sie z.B. die Langzeitbeobachtung der embryonalen Entwicklung ermöglicht.^[4][5] Sie kann aber auch mit Techniken, wie Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie kombiniert werden, um ortsaufgelöste Mobilitätsmessungen in (biologischen) Proben zu ermöglichen.^[6]

Einzelnachweise

1. ↑ Philipp J. Keller, Ernst H. K. Stelzer: Lichtscheiben-Mikroskopie in der molekularen Zellbiophysik In: LABORWELT 7. Jahrgang, Nr. 5/2006, S. 18–21, Online-Version
2. ↑ U. Krzic, S. Günther, L. Hufnagel, D. von Gegerfelt, H. Karlsson, E. Illy, J. Hel: Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie (SPIM) und Laser-Anregung in orange zur Abbildung lebender Organismen In: BioPhotonik Nr. 1/2011, S. 42–44, Online-Version
3. ↑ ^{a b} K. Greger, J. Swoger, E. H. Stelzer: Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. In: The Review of scientific instruments Band 78, Nummer 2, Februar 2007, S. 023705, ISSN 0034-6748. PMID 17578115.
4. ↑ P. J. Verveer, J. Swoger, F. Pampaloni, K. Greger, M. Marcello, E. H. Stelzer: High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. In: Nature methods Band 4, Nummer 4, April 2007, S. 311–313, ISSN 1548-7091. doi:10.1038/nmeth1017. PMID 17339847.
5. ↑ J. Huisken, J. Swoger, F. Del Bene, J. Wittbrodt, E. H. Stelzer: Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. In: Science (New York, N.Y.) Band 305, Nummer 5686, August 2004, S. 1007–1009, ISSN 1095-9203. doi:10.1126/science.1100035. PMID 15310904.
6. ↑ T. Wohland, X. Shi, J. Sankaran, E. H. Stelzer: Single plane illumination fluorescence correlation spectroscopy (SPIM-FCS) probes inhomogeneous three-dimensional environments. In: Optics express Band 18, Nummer 10, Mai 2010, S. 10627–10641, ISSN 1094-4087. PMID 20588915.