Pichia pastoris

Pichia pastoris
Systematik
Klasse: Saccharomycetes Unterklasse: Saccharomycetidae Ordnung: Saccharomycetales Familie: Saccharomycetaceae Gattung: Pichia Art: Pichia pastoris
Wissenschaftlicher Name
Pichia pastoris
(Guillierm.) Phaff

Pichia pastoris ist eine methylotrophe Hefeart, die eines der bedeutendsten Expressionssysteme der Biotechnologie darstellt. Zugleich ist P. pastoris ein für die Forschung wichtiger Modellorganismus.

Ein Vorteil gegenüber anderen Organismen stellt vor allem die Fähigkeit dar, Methanol als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle verwerten zu können (methylotroph). Methanol ist billiger als konventionelle Nährmedien, die auf diversen Sacchariden basieren. Des Weiteren kann P. pastoris in sehr hohen Zelldichten gezüchtet werden.

P. pastoris in der Biotechnologie

P. pastoris wurde erstmals in den 1970er Jahren von der Phillips Petroleum Company (heute: ConocoPhillips) in kommerziellem Maßstab kultiviert und direkt als proteinhaltiges Tierfutter vertrieben. Das Interesse an dem Hefepilz wurde vor allem durch seinen methylotrophen Charakter geweckt, da Methanol im Vergleich zu anderen Nährmedien sehr billig war. Bedingt durch die Ölkrise im Jahr 1973 stieg der Preis für Methanol erheblich, während zugleich der Preis für Sojabohnen, der größten alternativen Quelle für Tierfutter, sank. Die Verwendung von P. pastoris war somit für lange Zeit nicht mehr von wirtschaftlicher Bedeutung. Erst durch die fortschreitende Forschung im Bereich der Genetik und die Entwicklung rekombinanter DNA Technologien (Gentechnik) wurde im Laufe der Zeit P. pastoris als Expressionssystem zunehmend beliebter^[1]. Da die Hefe von der U.S.-amerikanischen Zulassungsbehörde, der Food and Drug Administration (FDA), den sog. GRAS-Status (general regarded as safe; generell als sicher eingestuft) erhielt, hat sie sich auch für die Produktion von pharmazeutischen Wirkstoffen etabliert. Dies ist u.a. dem Umstand zu verdanken, dass krankheitsverursachende Faktoren wie Pyrogene und lysogene Viren in Hefen nicht existent sind.

Aktuell werden mehr als 500 pharmazeutische Produkte sowie andere rekombinante Proteine in P. pastoris kloniert und hergestellt^[2]. In der folgenden Tabelle werden einige Beispiele für die Expression organismusfremder Proteine in P. pastoris genannt:

Organismus	Protein	Funktion/Wirkung
Säugetier/Mensch	Anti-HBs Fab-Fragment	Vorsorge u. Behandlung gg. Hepatitis-B-Virus
Säugetier/Mensch	Dopamin D2S Rezeptor	G-Protein
Säugetier/Mensch	DNA Topoisomerase I (hTopo I)	DNA-Replikation, -Transkription und Rekombination
Clostridium botulinum	Clostridium botulinum serotype F	Antigen
Escherichia coli	Escherichia coli phytase	Verwendung als Ergänzungsmittel für Tierfutter
Thermus aquaticus	Thermus aquaticus YT-1 Aqualysin I	Hitzestabile Serin-Protease
Rhizopus oryzae	Rhizopus oryzae Lipase	Katalytische Spaltung von Triacylglyceriden
Trametes versicolor	Trametes versicolor laccase (lcc1)	Phenoloxidase
Candida antartica	Candida antartica CBM–CALB fusion protein	Lypase
Hevea brasiliensis	Hevea brasiliensis hydroxynitrile lyase	Industrielle Enzyme for Biokatalyse
Amaryllidaceae	Amaryllidaceae Snowdrop Agglutinin	Bindung von D-Mannose Einheiten
Panax ginseng	Gsp (Panax ginseng C)	Potentieller Wirkstoff gegen Diabetes
Oryza sativa	Rice alpha-amylase (Amy 1A/3D)	Stärkehydrolyse

Das Pichia pastoris Expressionssystem

Die Verwertung von Methanol bedingt das Vorhandensein von Proteinen, welche Alkohol in den Stoffwechsel der Hefe einschleusen können. In P. pastoris sind dies vor allem die Alkoholoxidasen I und II (AOXI, AOXII), die als initiale Enzyme Methanol zu Wasserstoffperoxid und Formaldehyd oxidieren. Aber vor allem die Alkoholoxidase I weist eine sehr geringe Affinität für Sauerstoff auf; die Hefe kompensiert diesen Missstand, indem sie große Mengen an AOXI bildet (bis zu 30% des Zellproteins). Damit dies erst möglich wird, unterliegt das AOXI Gen der Kontrolle des sehr starken AOX Promotors, der nur bei Vorhandensein von Methanol zur Transkription des entsprechenden Gens führt. Daraus ergibt sich ein Promotor, der durch die Zugabe von Methanol induziert werden kann. Unterstellt man nun die Gensequenz eines rekombinanten Proteins der Kontrolle eines AOX Promotors (meist AOX1), kann in einem Fermentationsprozess die Akkumulierung von Biomasse von der eigentlichen Proteinproduktion getrennt werden, was zumeist angestrebt wird. Erst durch die Zugabe von Methanol als Induktor wird der AOX Promotor abgelesen und somit auch das rekombinante Protein synthetisiert^[3]. Darüber hinaus kann P. pastoris über einen weiten pH-Bereich hinweg kultiviert werden, ohne dass das Wachstum signifikant beeinträchtigt wird. Post-Translationale Modifikationen wie die Ausbildung von Disulfidbrücken oder die Glykosylierung von Proteinen (das Anhängen von spezifischen Zuckerresten) werden von der Hefe durchgeführt. Pichia kann zudem Proteine sehr effizient sekretieren, d.h. aus der Zelle ausschleusen, was nachfolgende Aufbereitungsschritte (Downstream Processing) erleichtert. In P. pastoris zur Anwendung kommende Vektoren, das sind jene genetischen Konstrukte, die das rekombinante Protein tragen, werden meist in das Wirtsgenom integriert.

Glykosylierung und „Humanization“

Vor allem der Glykosylierungsmechanismus von Hefen stellt ein wiederkehrendes Problem bei der Expression humaner, pharmazeutischer Wirkstoffe dar. Gewöhnlich werden in Hefen hergestellte Proteine hypermannosyliert, d. h. bis zu 200 Mannose-Reste werden daran angefügt (in P. pastoris: 8-14 Mannose-Reste). Diese Strukturen weichen in jedem Fall erheblich von der humanen Glykosylierung ab, die von einem komplexeren Typ ist. Sogenannte „hypermannosylierte“ Proteine sind im menschlichen Organismus teilweise funktionsunfähig, können allergische Reaktionen auslösen und weisen eine sehr kurze Halbwertszeit im humanen Serum auf, da sie va. von Mannose-Rezeptoren in der Leber gebunden werden^[4]. Um vollständig glykosylierte menschliche Proteine auch in einer Hochdichtefermentation mit P. pastoris herstellen zu können, wurde in den letzten Jahren an der „Humanization“ (Vermenschlichung) des Glykosylierungsapparates geforscht. Grundsätzlich werden unerwünschte Enzyme des Hefestoffwechsels, die z.B. für die Hypermannosylation verantwortlich zeichnen, entfernt, während Gene, die an der menschlichen Glykosylierung beteiligt sind, mittels rekombinanter DNA-Techniken in den Organismus eingeschleust werden. 2004 konnte so erstmals das Humanprotein Erythropoietin (EPO) in seiner natürlichen, humanen Glykosylierung in einem P. pastoris Stamm erzeugt werden^{[5] [6] [7]}. Das Ziel weiterer Forschungsarbeiten in diesem Bereich ist die Anwendung der Ergebnisse auf andere Expressionssysteme sowie die Steigerung der Expressionsraten.

Fußnoten

1. ↑ Cereghino J. L., Cregg J. M.; Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiology Reviews 24 (2000) 45-66
2. ↑ Macauley-Patrick S., Fazenda M. L., McNeil B., Harvey L. M.; Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast (2005); 22: 249–270.
3. ↑ http://www.microbialcellfactories.com/content/5/1/17
4. ↑ Neta D.; Asparagine-linked glycosylation in the yeast Golgi. Biochimica et Biophysica Acta 1426 (1999) 309-322
5. ↑ Hamilton S. R., Gerngross T. U. Glycosylation engineering in yeast: the advent of fully humanized yeast. Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1–6
6. ↑ Bretthauer R. K. ; Genetic engineering of Pichia pastoris to humanize N-glycosylation of proteins. Trends in Biotechnology 2003, 21:459-462.
7. ↑ Hamilton S. R., Bobrowicz P., Bobrowicz B., Davidson R. C., Li H., Mitchell T., Nett J.H., Rausch S., Stadheim T. A., Wischnewski H.; Production of complex human glycoproteins in yeast. Science 2003, 301:1244-1246.

Weiterführende Literatur

• Gellissen G (Ed) (2005) Production of recombinant proteins - novel microbial and eukaryotic expression systems. Wiley-VCH, Weinheim ISBN 978-3-527-31036-4

• Cregg J (2007) Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Press; 2.Auflage ISBN 978-1588294296