- Polyacrylamid-Gelelektrophorese
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Moderne Gelelektrophoreseapparatur
Ein Polyacrylamid-Gel zwischen 2 Glasplatten. Der Kamm dient der Aussparung von Proben-Taschen.
Reaktion zwischen Acrylamid und N,N-Methylenbisacrylamid
N,N′-DiallyltartardiamidDie Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ist in der Biochemie eine Methode zum Auftrennen von Molekülen, insbesondere von Proteinen und Nukleinsäuren.
Inhaltsverzeichnis
Herstellung (Slabgel)
Für die Elektrophorese wird das Gel durch radikalische Polymerisation aus den Stoffen Acrylamid und N,N'-Methylenbisacrylamid (gewöhnlich im Verhältnis 37,5:1) hergestellt. Letzteres dient zur Quervernetzung der ansonsten linearen Polyacrylamid-Ketten. Nur so entsteht ein starres Gel.
Wenn man an Stelle von N,N'-Methylenbisacrylamid N,N'-Diallyltartardiamid verwendet, dann kann man das Gel nach dem Trennlauf mit Natriumperiodatlösung durch Glykolspaltung wieder auflösen, was die Untersuchung der getrennten Substanzen erleichtert.
Das Gel besteht aus einem Trenngel, über das eine niedrige Schicht Sammelgel pipettiert wird. Die Mischungen für beide werden zunächst je nach gewünschter Zusammensetzung getrennt voneinander vorbereitet. Der pH-Wert des eingesetzten Puffers, die Konzentration von Acrylamid und der Gehalt an Bisacrylamid in der Ausgangsmischung bestimmen die Trenneigenschaften des Gels.
Die Trenngel-Mischung wird mit dem Radikalstarter Ammoniumperoxodisulfat (APS) sowie dem Polymerisierungskatalysator Tetramethylethylendiamin (TEMED) versetzt und zügig zwischen zwei abgedichtete Glasplatten gegossen, die durch einen Abstandhalter (Spacer) voneinander getrennt sind (der Abstand beträgt etwa 1,5mm). Dabei dürfen keine Bläschen im Gel verbleiben. Die Scheiben müssen absolut sauber und fettfrei sein.
Wenn man an Stelle von Ammoniumperoxodisulfat Riboflavin verwendet, dann kann man mit Hilfe von hellem, blau-violettem Licht den Zeitpunkt der Polymerisation selbst bestimmen, was einen größeren zeitlichen Spielraum für das Gießen des Gels erlaubt.
Die Giftigkeit des unpolymerisierten Acrylamids macht außerdem die Verwendung von Handschuhen erforderlich. Nach dem vollständigen Auspolymerisieren ist das Gel allerdings weitgehend gesundheitlich unbedenklich. Das Trenngel wird schließlich mit etwas Wasser oder Isopropanol überschichtet, um zum einen eine Glättung der Gelgrenze zu erreichen und zum anderen den Kontakt mit Sauerstoff auszuschließen, da der Luftsauerstoff die zur Polymerisation notwendigen Radikale abfangen und somit eine korrekte Polymerisation des Gels stören würde.
Nach etwa 45 Minuten ist das Trenngel auspolymerisiert und das Wasser bzw. der Alkohol kann abgegossen oder abgesaugt werden. Danach wird das Sammelgel mit APS und TEMED versetzt und etwa einen Zentimeter hoch über das Trenngel pipettiert. Um Taschen zum Einfüllen der Proben zu erhalten, wird ein spezieller Kamm eingesteckt. Eine Überschichtung mit Wasser/Alkohol ist dank des eingesteckten Kammes überflüssig. Nach etwa 20 Minuten ist auch dieses Gel auspolymerisiert und der Kamm kann entfernt werden.
Verfahrensweise
Das fertige Polyacrylamid-Gel wird in eine Elektrophorese-Apparatur eingespannt.
In die ausgesparten Taschen werden die Proben pipettiert. Eine Tasche wird meistens mit einer Referenz, z.B. einem Proteinstandard, der mehrere Proteine bekannter Größe beinhaltet, befüllt. Es wird zudem ein sichtbarer, negativ geladener Farbstoff (z.B. Bromphenolblau) zugesetzt.
Da die zu trennenden Moleküle eine Ladung besitzen, werden sie beim Anlegen einer Spannung durch das Polymer "gezogen" und abhängig von Ladung, Größe, Molmasse und Beschaffenheit des Trennmediums elektrophoretisch aufgetrennt (siehe Gelelektrophorese).
Die Gittergröße wird durch die Konzentration des Acrylamids bestimmt. Zur Auftrennung von größeren Molekülen ist eine geringere Konzentration Acrylamid erforderlich als für kleinere.
Die Elektrophorese wird beendet, sobald der Farbstoff das Gel durchlaufen hat. Anschließend werden die Protein-Banden im Gel durch Färbung sichtbar gemacht (Coomassiefärbung oder Silberfärbung).
Anwendung
Acrylamid-Gele eignen sich zur Auftrennung von Proteinen mit Molmassen zwischen 5 und 500 kDa.
Es existieren verschiedene Varianten der PAGE:
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