- Gelelektrophorese
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Versuchsaufbau
Moderne Gelelektrophoreseapparatur
GelelektrophoreseapparaturGelelektrophorese (Wortteile: Gel|elektro|phorese – letzterer abgeleitet von griech. pherein φερειν = tragen) ist eine analytische Methode der Chemie und Molekularbiologie, um verschiedene Arten von Molekülen zu trennen. Dabei wandert eine Mischung aus zu trennenden Molekülen unter Einfluss eines elektrischen Felds (siehe dazu: Elektrophorese) durch ein Gel, welches in einer ionischen Pufferlösung liegt. Je nach Größe und Ladung der Moleküle bewegen sich diese unterschiedlich schnell durch das als Molekularsieb wirkende Gel. Dabei wandern kleine, negativ geladene Moleküle (Anionen) am schnellsten in Richtung der positiv geladenen Anode und positiv geladene Moleküle (Kationen) in Richtung der negativ geladenen Kathode.
Inhaltsverzeichnis
Gel-Matrix
Die Moleküle des Gels, beispielsweise Agarose (siehe Agarose-Gelelektrophorese) oder polymerisiertes Acrylamid (Polyacrylamid; siehe Polyacrylamid-Gelelektrophorese), bilden ein engmaschiges Netz, das die zu trennenden Moleküle bei ihrer Wanderung im elektrischen Feld behindert.
Agarose-Gele sind relativ großporig (150 nm bei einprozentigen, 500 nm bei 0,16-prozentigen Gelen) und eignen sich gut zur Trennung von DNA und hochmolekularen Proteinen. Polyacrylamid-Gele weisen wesentlich kleinere Poren auf (3–6 nm). Die Porengröße hängt von der Acrylamidkonzentration und dem Vernetzungsgrad ab.
Je nach Anwendung werden dem Gel verschiedene Zusatzstoffe zugesetzt, beispielsweise SDS bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) oder Ampholyte bei der Isoelektrischen Fokussierung (IEF). SDS denaturiert und entfaltet Proteine, so dass sie, von SDS eingehüllt, kettenförmig gelöst schwimmen. Die Ladungsdichte solcher Ketten ist, unabhängig von ihrer Länge, ungefähr gleich. Aus diesem Grunde haben die SDS-Protein-Komplexe in freier Lösung, d. h. ohne die zusätzliche Einwirkung von Gelen, gleiche Wanderungsgeschwindigkeit, in einem Gel ist die Wandergeschwindigkeit jedoch nicht mehr gleich und es erfolgt eine Trennung nach der Größe. Es ist aber auch nicht unüblich, auf das SDS zu verzichten, wenn den Proben schon vor der Auftragung SDS im Probenpuffer zugegeben wird.
Gele können ohne großen Aufwand selbst hergestellt werden, wobei es doch etwas Erfahrung erfordert, das Gel auf Anhieb dicht zu bekommen. Fertige Gele und die entsprechenden Puffersysteme können zudem kommerziell erworben werden.
Durchführung
Die klassische Gelelektrophorese wird als Zonenelektrophorese durchgeführt. Eine Methode zur Erzielung einer höheren Auflösung ist die diskontinuierliche Elektrophorese.
Bei der Gelelektrophorese entsteht Wärme. Diese muss abgeführt werden, um optimale Bedingungen zu gewährleisten. Deswegen sollte die Gelelektrophorese in gekühlten Apparaturen bei konstanten Temperaturen durchgeführt werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Im Idealfall wird die Elektrophorese beendet, wenn die kleinsten beziehungsweise mobilsten Moleküle das Ende des Gels erreicht haben. Das garantiert die höchstmögliche Auftrennung der Moleküle.
Auswertung
Agarose-Gel mit DNA und Lauffarbstoff in den Geltaschen, vor der Elektrophorese.
DNA-Banden unter UV-Licht im durch Ethidiumbromid gefärbten Agarose-Gel.Zur Auswertung des Gels nach der Elektrophorese werden die zu trennenden Moleküle entweder vor der Elektrophorese radioaktiv markiert und anschließend in einer Autoradiographie nachgewiesen oder nach der Elektrophorese mit verschiedenen Farbstoffen wie beispielsweise Ethidiumbromid „gefärbt“ und unter UV-Licht betrachtet. So verfährt man etwa mit DNA-Fragmenten. Proteine können angefärbt werden (siehe dazu: Färbung nach Fairbanks, Silberfärbung) und/oder immunologisch nachgewiesen werden (Western Blot).
Gleiche Moleküle laufen in diskreten Zonen – umgangssprachlich als Banden bezeichnet – durch das Gel. Mehrere Proben können parallel nebeneinander gleichzeitig durch dasselbe Gel laufen. Ist die Größe einiger Moleküle bekannt, kann man durch Vergleich von deren Banden mit den restlichen Banden die Größe der anderen Moleküle abschätzen. Solche Molekülmassenstandards sind kommerziell erhältlich. Ähnlich funktioniert auch ein Comigrationsstandard, mit dessen Hilfe eine unbekannte mit einer bekannten Probenzusammensetzung verglichen wird. Als Molekülmassenstandards werden DNA (Desoxyribonukleinsäure) oder Proteine verwendet.
Eine Bestimmung der Menge einer Substanz in einer Bande beziehungsweise der relative Anteil einer Bande (siehe: Quantifizierung) ist nach der Färbung des Gels und einer anschließenden densitometrischen Auswertung möglich. Zur Bestimmung der Messwerte eines Geles wie z. B. Laufweiten, Molekülmassen, Quantifizierungen oder Normalisierung wird in den meisten Fällen eine Auswertungssoftware genutzt.
Einsatzgebiete
Gelelektrophorese wird in der Molekularbiologie und der Biochemie häufig verwendet:
Gelelektrophorese Variante Einsatzgebiet Agarose-Gelelektrophorese Analytik von
Desoxyribonukleinsäure (DNA)
Ribonukleinsäure (RNA)1Nativ-Gelelektrophorese Saure Nativ-Gelelektrophorese
Blaue Nativ-GelelektrophoreseProteinanalytik2 SDS-PAGE 2D-Gelelektrophorese Proteinanalytik2 Isoelektrische Fokussierung Proteinanalytik2 QPNC-PAGE Analytik von
MetalloproteinenSiehe auch
Weblinks
Commons: Gelelektrophorese – Sammlung von Bildern, Videos und Audiodateien
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