- Taq
-
Taq-Polymerase I —
Vorhandene Strukturdaten: s. UniProt Größe 835 Aminosäuren Bezeichner Gen-Name(n) polA Externe IDs UniProt: P19821 Enzymklassifikation EC, Kategorie 2.7.7.7 Nukleotidyltransferase Substrat Desoxyribonucleosidtriphosphat + DNAn Produkte Diphosphat + DNAn+1 Die Taq-Polymerase ist die DNA-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus (Taq). Sie ist außerordentlich hitzebeständig, da das Bakterium in Geysiren bei etwa 70 °C lebt. 1969 wurde die Taq-Polymerase erstmals von Thomas Brock und Hudson Freeze isoliert.
Das Enzym wird hauptsächlich zur DNA-Vervielfältigung mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt. DNA-Polymerasen von mesophilen Organismen würden bei Erhitzung während der Polymerase-Kettenreaktion denaturiert und müssten nach jedem Zyklus neu hinzugegeben werden. Bei der DNA-Vervielfältigung mit Taq-Polymerase ist dies nicht notwendig da das Enzym auch bei hohen Temperaturen noch sehr stabil ist (die Enzym-Halbwertszeit beträgt bei 97,5 °C ca. 9 Minuten[1]). Die DNA-Amplifikation mit Taq ist jedoch fehleranfällig, denn das Enzym besitzt keine proof reading-Funktion. In den amplifizierten DNA-Fragmenten finden sich deshalb Mutationen, die durch ungenaues Kopieren des Matritzenstranges entstehen. Werden sequenzexakte DNA-Amplifikate benötigt empfiehlt sich daher der Einsatz anderer Polymerasen, etwa von Pfu- oder Pfx- Polymerasen (die ursprünglich ebenfalls aus thermophilen Mikroorganismen isoliert wurden) deren Verwendung jedoch einen deutlich größeren Kostenfaktor darstellt.
Bei der Amplifikation eines DNA-Fragments hängt die Taq-Polymerase ein zusätzliches Nukleotid (dATP) an das 3'-Ende des synthetisierten Strangs. Man spricht von einem 3'-A-Überhang (A für Adenin), da sich auf dem Matrizenstrang keine komplementäre Nukleobase (Thymin) befindet. Der 3'-Überhang wird durch das Fehlen der proof reading-Funktion nicht korrigiert und findet Anwendung beim Verfahren der TA-Klonierung.
Die Massenproduktion des Enzyms erfolgt durch Übertragung des Gens auf einen Stamm des Bakteriums Escherichia coli. Aus diesen Kulturen wird das Protein gereinigt und in einem glycerolhaltigen Puffer bei −20 °C aufbewahrt.
Einzelnachweise
- ↑ Lawyer, F.C. et al. (1993): High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. In: PCR Methods Appl. Bd. 2, S. 275-287. PMID 8324500
Siehe auch
Wikimedia Foundation.
