Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie

Vergleich der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie (A,D) mit der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (B,E) mit der dazugehörigen Verteilung der Fluoreszenzlebensdauern (C,F). Die Aufnahmen zeigen eingefärbte Zellkerne und die Abnahme der Fluoreszenzlebensdauern in den Abbildungen C-F, bedingt durch die Zugabe eines weiteren Fluoreszenzfarbstoffes, deutet auf einen Förster-Resonanzenergietransfer hin.

Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (engl. Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy FLIM) ist ein Fluoreszenz-basiertes bildgebendes Verfahren der Mikroskopie. Im Gegensatz zu anderen fluoreszenzmikroskopischen Verfahren beruht die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie nicht auf einer Messung der Fluoreszenzintensität, sondern auf der Messung der unterschiedlichen Lebensdauern der angeregten Zustände fluoreszierender Moleküle. Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie wird insbesondere in Verbindung mit der Konfokalmikroskopie und der Multiphotonenmikroskopie angewendet.

Physik

Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie beruht auf einer Messung der Fluoreszenzlebensdauer angeregter fluoreszierender Moleküle. Die Fluoreszenzlebensdauer ist dabei die mittlere Zeit $\tau\!\,$, die ein Molekül im angeregten Zustand verbleibt, bevor es unter Abgabe eines Photons in seinen Grundzustand zurückkehrt. Der Fluoreszenzabbau spiegelt sich in einer exponentiellen Abnahme der Fluoreszenzintensität I mit der Zeit t wider:

$I(t)=I_0 \exp \left(-\frac{t}{\tau}\right)$.

Zugleich ist die Fluoreszenzlebensdauer umgekehrt proportional zur Summe der Zerfallsraten k für strahlende und nichtstrahlende Prozesse.

$\frac{1}{\tau} = \sum k_i$

Die Fluoreszenzlebensdauer eines Farbstoffs ist unter anderem von seiner Identität und seiner chemischen Umgebung abhängig. Sie wird durch Energietransfermechanismen, wie dem Förster-Resonanzenergietransfer, beeinflusst. Die Fluoreszenzlebensdauer ist jedoch unabhängig von der initialen Fluoreszenzintensität.

Messung

Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie liefert Bilder mit der Fluoreszenzlebensdauer für jedes Pixel des Bildes. Die Messung der Fluoreszenzlebensdauer in der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie beruht entweder auf einer pulsatilen Anregung und einer Messung des zeitlichen Fluoreszenzabfalls, oder auf einer intensitätsmodulierten Anregung und einer Messung der Phasenverschiebung.

Pulsatile Illuminierung

Die theoretisch einfachste Methode zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer besteht in der Zählung freigesetzter Photonen mit Hilfe der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung, nach periodischer Anregung mit ultrakurzen Delta-Lichtimpulsen im Picosekundenbereich. Bei ausreichend kurzer Anregung kann für die meisten Proben eine zeitabhängige exponentielle Abnahme der Fluoreszenzintensität im Nanosekundenbereich beobachtet werden, aus der die Fluoreszenzlebensdauer bestimmt werden kann.

Phasenmodulierung

Mit Hilfe der Phasenfluorimetrie wird in der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie die Fluoreszenzlebensdauer über die Phasenverschiebung nach einer intensitätsmodulierten Anregung bestimmt. Die Anregungsintensität wird hierbei wellenförmig mit einer hohen Frequenz (ω), beispielsweise mit Hilfe eines akustooptischen Modulators moduliert. Das Fluoreszenzsignal folgt dem Anregungssignal dank des zeitlich begrenzten Verbleibs des Fluoreszenzfarbstoffs, welcher sich in der Fluoreszenzlebensdauer widerspiegelt, in seinem angeregten Zustand zeitversetzt. Zudem wird die Amplitude des Signals reduziert. Die Fluoreszenzlebensdauer wird nachfolgend über die Phasenverschiebung Δφ oder über die Reduktion der Modulationsamplitude M zwischen Anregungs- und Fluoreszenzsignal bestimmt:

$\tau_\phi = \omega^{-1} \tan {\Delta\phi} \!$

bzw.

$\tau_M = \omega^{-1} \sqrt {M^{-2}-1} \!$

Literatur

• Theodorus W. J. Gadella: FRET and FLIM techniques. Amsterdam: Elsevier 2009, ISBN 0-08-054958-6
• A. Periasamy, R. M. Clegg: Flim Microscopy in Biology and Medicine. CRC Press 2010, ISBN 9781420078909

Weblinks

• Olympus Corporation: Applications in Confocal Microscopy: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM). Abgerufen am 2010. April 3.
• Application Note: Two-photon fluorescence lifetime imaging (2P-FLIM) for ion sensing in living cells PicoQuant GmbH 2008 (pdf-Datei, 537 kB)
• Application Note: Quantitative in vivo imaging of molecular distances using FLIM-FRET PicoQuant GmbH 2009 (pdf-Datei, 636 kB)