Plasmidkopienzahl

Die Plasmidkopienzahl beschreibt die Zahl an Plasmiden einer Art pro Zelle.

Man unterscheidet zwischen

• low-copy Plasmidkopienzahl zwischen 1–12 pro Zelle
• medium-copy Plasmidkopienzahl zwischen 15–20 pro Zelle
• high-copy Plasmidkopienzahl zwischen 20-700 pro Zelle ^[1]

Die Unterschiede in der Kopienzahl entstehen durch die unterschiedliche Funktionsweise des origin of replication und der in ihm codierten Gene. Die Sequenz des Plasmids P15A beispielsweise führt zur Ausprägung des low-copy-Typs, jene vom Plasmid pBR322 zum medium-copy Typ. Eine einfache Punktmutation im Gen für die RNA II des oris des pBR322-Plasmids, kombiniert mit der Deletion eines Kontrollproteins, zum high-copy Typ^[2]. Auch andere Mutationen können zur Erhöhung der Kopienzahl führen ^[3]. Kopienzahl und Wachstum von plasmidhaltigen Zellen beeinflussen sich wechselseitig. Eine hohe Kopienzahl bedeutet eine hohe metabolische Belastung der Zellen und führt unter Umständen zu deutlich verringertem Wachstum^{[4] [5]}. Die Wachstumsgeschwindigkeit einer Zelle wiederum beeinflusst die Kopienzahl. Eine Verringerung der Wachstumsgeschwindigkeit sorgt für einen Anstieg der Kopienzahl.^[6]

Zur Produktion rekombinanter Proteine werden meist Plasmide der Kategorie high-copy eingesetzt. Für diesen Einsatz gelten drei Regeln die nacheinander Anwendung bei der Optimierung der Expressionsleistung finden:

• Hohe Plasmidkopienzahl führt zu hoher Genexpression ^[7].
• Erfolgt trotz Erhöhung der Kopienzahl keine Steigerung der Menge an Expressionsprodukt so besagt die zweite Regel, dass die Produktion von Expressionsprodukten den Limitierungen des Zellmetabolismus unterliegt, ^[8] da die Transkriptions- bzw. Translationskapazitäten der Zellen erschöpft sein können. ^[9]
• Die dritte Regel besagt, dass auch die Verringerung der Kopienzahl zur Steigerung der Produktmenge führen kann, dass das Plasmid stabiler^[10] und damit leistungsfähiger für das gewünschte Produkt ist. Gerade für die Expression von Proteinen, die toxisch für den Wirt sind, eignen sich häufig low-copy-Plasmide.^[11]

Definition der Plasmidkopienzahl

Es existieren in der Fachliteratur unterschiedliche Definitionen der Plasmidkopienzahl. Die zwei häufigsten definieren die Kopienzahl als Plasmidkopien pro Zelle ^[12] oder als Plasmidkopien pro Chromosom ^[13]. Weiterhin üblich sind Mengenangaben wie z. B. fmol Plasmid pro mg Trockenbiomasse ^[14], relative Angaben die einen Bezug zu einem Vergleichsplasmid herstellen, wie etwa x-fache Kopienzahl bezogen auf ein Wildtypplasmid ^[15] oder ein Wert für die Produktausbeute mg Plasmid-DNA pro g Zelltrockengewicht ^[16].

Bestimmung der Plasmidkopienzahl

Es gibt verschiedene direkte und indirekte Methoden die Plasmidkopienzahl zu bestimmen. Beim Einsatz indirekter Methoden werden nicht die Plasmide direkt, sondern Genprodukte quantifiziert, wie etwa die Messung der Aktivität von plasmidkodierter β-Lactamase ^[17]. Hierbei wird ein direkter proportionaler Zusammenhang zwischen Enzymaktivität und Plasmidkopienzahl angenommen. Diese Annahme trägt jedoch nicht der Tatsache Rechnung, dass die Expression eines Enzyms und die Enzymaktivität von anderen Faktoren beeinflusst werden die unabhängig von der Plasmidkopienzahl sind. Daher ist diese Methode nur eingeschränkt nutzbar ^[18]. Ähnliche Systeme existieren mit anderen Reporterproteinen wie Luziferase ^[19].

Bei direkten Methoden zur Bestimmung der Kopienzahl wird die Plasmidmenge nach einem Zellaufschluss bestimmt. Neben der Dot-blot Methode, bei der die Plasmidmenge häufig durch radioaktiv markierter Gensonden bestimmt wird <...?>^[20].

Am häufigsten erfolgt hierbei nach dem Zellaufschluss eine Isolierung bzw. eine Trennung der Plasmide von der chromosomalen DNA. Die hierfür verwendeten Methoden sind HPLC ^[21], Dichtegradientenzentrifugation^[22] oder Gelelektrophorese ^[23] sowie gepulste Gelelektrophorese ^[24]. Die Plasmidmenge wird hierbei über unterschiedliche Methoden quantifiziert. Etwas durch UV-Absorption bei der HPLC oder durch die Messung der Radioaktivität bei einer Dichtegradientenzentrifugation. Hierzu müssen vorher bei der Replikation der Plasmide Radionuklide für den Einbau vorgelegt werden. Ebenfalls zur Quantifizierung der Plasmide nach einer Gelelektrophorese kann ein Southern-blot eingesetzt werden oder auch durch markierte Gensonden erfolgen ^[25].

Die Bestimmung von Plasmidkopienzahlen nach den genannten Methoden erzeugt immer einen Durchschnittswert, der durch plasmidfreie Zellen in der Kultur stark verfälscht werden kann.

Einzelnachweise

1. ↑ Mayer M.P. (1995): A new set of useful cloning and expression vectors derived from pBluescript. Gene 163 41-46.
2. ↑ Boros I., Pósfai G., Venetianer P. (1984): High-copy-number derivatives of the plasmid cloning vector pBR322. Gene 30 257-260.
3. ↑ Müller A.K., Rojo F., Alonso J.C. (1995): The level of the pUB110 replication initiator proteins is autoregulated, which provides an additional control for plasmid copy number. Nucleic Acids Res. 23 1894-1900.
4. ↑ Mason C.A., J.E Bailey. (1989): Effects of plasmid presence on growth and enzyme activity of Escherichia coli DH5α. Appl. Microbiol. Biotechnol. 32 54-60.
5. ↑ Lee J.H., Lee K.J. (1996): Analysis of expression rate of cloned β-lactamase gene in a recombinant of Streptomyces lividans. J. Biotechnol. 52 161-165.
6. ↑ Kramer W., Mattanovitch D., Elmecker G., Weik R., Luettich C., Bayer K., Katinger H. (1994): Regulable expression systems for the optimisation of recombinant protein production in Escherichia coli. Prog. Biotechnol. 9 827-830.
7. ↑ French C., Ward J.M. (1996): Production and modification of E. coli transketolase for large-scale biocatalysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 799 11-18.
8. ↑ Nacken V., Achstetter T., Degryse E. (1996): Probing the limits of expression levels by varying promoter strength and plasmid copy number in Saccharomyces cerevisiae. Gene 175 253-260.
9. ↑ Kim J.Y., Ryu D.D.Y. (1991): The effects of plasmid content, transcription efficiency and translation efficiency on the productivity of a cloned gene product in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 38 1271-1279.
10. ↑ La Fontaine S., Firth S.D., Lockhart P.J., Paynter J.A., Mercer F.B. (1998): Eukaryotic expression vectors that replicate to low copy number in bacteria: Transient expression of the MENKES protein. Plasmid 39 245-251.
11. ↑ Müller J., Van Dijl J.M., Venema G., Bron S. (1996): Cloning of heterologous genes specifying detrimental proteins on pUC-derived plasmids in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 252 207-211.
12. ↑ Leipold R.J., Krewson C.E., Dhurjati P. (1994): Mathematical model of temperaturesensitive plasmid replication. Plasmid 32 131-167.
13. ↑ Kiewiet R.J., Kok J.F. Seegers M.L., Venema G., Bron. S. (1993): The mode of replication is a major factor in segregational plasmid instability in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 59 358-364.
14. ↑ Schendel F.J., Baude E.J., Flickinger. M.C. (1989): Determination of protein expression and plasmid copy number from cloned genes in Escherichia coli by flow injection analysis using an enzyme indicator vector. Biotechnol. Bioeng. 34 1023-1036.
15. ↑ Austin S. J., Eichorn B.G. (1992): Random diffusion can account for topA-dependent suppression of partition defects in low-copy-number plasmids. J. Bacteriol. 174 5190-5195.
16. ↑ Schmidt T., Friehs K., Flaschel E. (1996): Rapid determination of plasmid copy number. J. Biotechnol. 49 219-229.
17. ↑ Miller C.A., Cohen S.N. (1993): The partition par locus of pSC101 is an enhancer of plasmid incompatibility. Mol. Microbiol. 9 695-702.
18. ↑ Betenbaugh M.J., di Pasquantonio V.M., Dhurjati P. (1987): Growth kinetics of Escherichia coli containing temperature-sensitive plasmid pOU140. Biotechnol. Bioeng. 29 1164-1172.
19. ↑ Coronado C., Vazquez M.E., Cebolla A., Palomares A.J. (1994): Use of firefly luciferase gene for plasmid copynumber determination. Plasmid 32 336-341.
20. ↑ Hinnebusch J., Barbour A.G. (1992): Linear- and circular-plasmid copy numbers in Borrelia burgdorferi. J. Bacteriol. 174 5251-5257.
21. ↑ Coppella S.J., Acheson C.M., Dhurjati P. (1987): Measurement of copy number using HPLC. Biotechnol. Bioeng. 29 646-647.
22. ↑ Weaver K.E., Clewell D.B., An F. (1993): Identification characterization and nucleotide sequence of a region of Enterococcus faecalis pheromone-responsive plasmid pAD1 capable of autonomous replication. J. Bacteriol. 175 1900-1909.
23. ↑ Projan S.J., Carleton S., Novick R.P. (1983): Determination of plasmid copy number by fluorescence densitometry. Plasmid 9 182-190.
24. ↑ Ward A.C., Hillier A.J., Davidson B.E., Powell I.B. (1993): Stability analysis of the Lactococcus lactis DRC1 lactose plasmid using pulsed-field gel electrophoresis. Plasmid 29 70-73.
25. ↑ Olsson T., K.Ekwall, T. Rusla. (1993): The silent P mating type locus in fission yeast contains two autonomously replicating sequences. Nucleic Acids Res. 21 855-861.