Phasenkontrastverfahren

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Das Phasenkontrast-Verfahren ist ein Abbildungsverfahren in der Lichtmikroskopie, bei dem die Phasenverschiebung des Lichts beim Durchstrahlen einer transparenten Probe in ein Bild mit Amplitudenkontrast (Helligkeitsvariation) umgewandelt wird. So ist eine direkte Abbildung von Strukturen möglich, die nur einen geringen Eigenkontrast aufweisen und sich z. B. nur geringfügig in der Dichte und damit im Brechungsindex unterscheiden. Weit verbreitet ist das Phasenkontrastmikroskop für die Untersuchung biologischer Proben. Das Phasenkontrastverfahren wurde 1932 vom niederländischen Physiker Frits Zernike entwickelt und 1941 durch die Jenaer Werke in die mikroskopische Praxis eingeführt. 1953 erhielt Zernike für seine Entdeckung den Nobelpreis für Physik.

Kontrast in der Lichtmikroskopie

Amplituden- und Phasenobjekt

Die Erkennbarkeit von Details in einem Bild hängt von der Auflösung und dem Kontrast des Bildes ab. Insbesondere die Lichtmikroskopie von biologischen Objekten wird in vielen Fällen durch Kontrastarmut der erzeugten Bilder beeinträchtigt, nämlich immer dann, wenn die Objekte nicht durch allgemeine Lichtabsorption (Abdunklung), durch spektral spezifische Lichtabsorption (Eigenfarben) oder durch sehr starke Unterschiede im Lichtbrechungsindex mit ausreichendem Kontrast erscheinen. Deshalb gibt es verschiedene Methoden, um den Kontrast zu erhöhen. Zum Beispiel werden einzelne Objekte oder ihre Bestandteile spezifisch mit Farbstoffen angefärbt. Eine andere Methode ist, die Beleuchtungsapertur zu verringern, indem man die Irisblende des Beleuchtungsapparats (des Kondensors) verengt. Dadurch werden Objektteile mit unterschiedlichem Lichtbrechungsindex mit stärkerem Kontrast dargestellt. Dieses Verfahren hat aber den schwerwiegenden Nachteil, dass die Auflösung des Bildes stark verringert wird, denn das Auflösungsvermögen des Mikroskops ist von der numerischen Apertur der Objektbeleuchtung abhängig.

Prinzip des Phasenkontrast-Verfahrens

Im Unterschied zur Methode der Verringerung der Beleuchtungsapertur nutzt das Phasenkontrast-Verfahren von Frits Zernike Unterschiede im Lichtbrechungsindex und der Dicke der Objekte auf andere Weise zur Erzeugung eines Hell-Dunkel-Kontrasts aus, und zwar ohne die Beleuchtungsapertur und damit das Auflösungsvermögen des Mikroskops wesentlich zu verringern. Da sich Licht in Medien mit verschiedenen Lichtbrechungsindizes mit verschiedener Geschwindigkeit ausbreitet, ergibt sich beim Durchlaufen eines Objekts, das optisch dichter ist (höherer Lichtbrechungsindex) als seine Umgebung (Hintergrund), ein Phasenunterschied gegenüber dem Licht der Umgebung (Hintergrundlicht).

Bei der Phasenkontrastmikroskopie wird dieser Phasenunterschied zur Erzeugung eines Kontrasts genutzt. Die Phasenlage des Hintergrundlichts wird – ohne das Objektlicht zu beeinflussen – mittels eines in der hinteren Brennebene des Objektivs befindlichen optisch dichten Elements (ein Ring aus durchsichtigem, optisch dichtem Material, der sogenannte Phasenring) so weit verschoben, dass das Hintergrundlicht bei Interferenz mit dem Objektlicht dieses möglichst weitgehend schwächt. Dadurch erscheint nun das Objekt dunkel vor hellem Hintergrund. Dies wird als positiver Phasenkontrast bezeichnet.

Die Möglichkeit zur Beeinflussung des Hintergrundlichts unabhängig vom Objektlicht wird dadurch erzielt, dass die Aperturblende der Objektbeleuchtung ringförmig ist (Ringblende im Kondensor statt wie sonst üblich kreisförmige Blende) und ein Bild dieser Kondensorblende in der hinteren Brennebene des Objektivs erzeugt wird, wo sich der Phasenring befindet. Voraussetzung für das Verfahren ist deshalb die Köhlersche Beleuchtung, bei der das Hintergrundlicht parallel den Kondensor verlässt und, soweit es durch das Objekt nicht beeinflusst wird, auch parallel in das Objektiv eintritt.

Damit größtmöglicher Kontrast erzielt wird, muss die Phasenverschiebung des Hintergrundlichts auf das Ausmaß des Phasenunterschieds zwischen Objektlicht und Hintergrundlicht abgestimmt sein. Der Phasenring im Objektiv muss also ungefähr entsprechend den am meisten vorkommenden Lichtbrechungsindizes und Dicken der betrachteten Objekte bemessen sein. So schlägt der Kontrast bei Objekten mit besonders hohem Lichtbrechungsindex (zum Beispiel Endosporen von Bakterien) um und sie werden heller als der Hintergrund dargestellt. Bei einem seltener angewendeten Verfahren ist der Phasenring so bemessen, dass sich auch bei üblichen Objekten ein umgekehrter Kontrast ergibt, dass sie also hell auf dunklerem Hintergrund erscheinen; dies wird als negativer Phasenkontrast bezeichnet.

Auflösung: Durch die Benutzung des Phasenkontrast-Verfahrens wird die Auflösung eines Mikroskops nicht über die Beugungsgrenze hinaus verbessert.

Anwendungen

Am häufigsten wird das Phasenkontrast-Verfahren in der Lichtmikroskopie biologischer Objekte eingesetzt. Insbesondere bei der Beobachtung von Zellen, die im normalen Lichtmikroskop nahezu unsichtbar sind, ergeben sich kontrastreiche Bilder ohne die Notwendigkeit einer Färbung.

Bei der Pollenanalyse können mit Hilfe des Phasenkontrast-Verfahrens auch feinste Strukturen der Oberfläche von Pollenkörnern sichtbar gemacht werden.

Weiterhin beruht die Bildentstehung in der hochauflösenden Transmissionselektronenmikroskopie und in hochauflösender Hellfeld-Raster-Transmissionselektronenmikroskopie auf dem Effekt des Phasenkontrasts – dabei jedoch dem der Wellenfunktionen der Strahlelektronen.

Weblinks

• Gute Beschreibung mit Schema-Abbildung
• Sehr detailliertes umfangreiches Tutorium
• Lichtmikroskopie online Theoretische Einführung und Anleitung zur praktischen Anwendung
• Entwicklung des Phasenkontrastverfahrens Historischer Abriss mit Schwerpunkt Zellbiologie