Viraler Vektor

Als Virale Vektoren werden gezielt veränderte Viruspartikel bezeichnet, die in der Gentechnik dafür verwendet werden, genetisches Material in Zielzellen zu schleusen. Dies können Zellen eines lebenden Organismus (in vivo) oder Zellen einer Zellkultur (in vitro) sein. Der Transport von DNA in eine Zelle mit Hilfe eines Virus wird als Transduktion bezeichnet, die Zellen, die solche DNA tragen, als transduzierte Zellen. Virale Vektoren werden in der Grundlagenforschung und in der Gentherapie verwendet. Auch Impfstoffe auf der Grundlage von viralen Vektoren, sogenannte Virus-like particles (VLP), sind bereits im Einsatz. Die Technik der viralen Vektoren wurde erstmals in den 1970er Jahren verwendet und seitdem ständig weiterentwickelt.

Eigenschaften viraler Vektoren

Um mit einem viralen Vektor genetisches Material in Zielzellen mittels Transduktion einzubringen, muss zunächst die gewünschte DNA-Sequenz in das Genom der Viren kloniert werden. Dabei werden in den meisten Fällen bestimmte DNA-Bereiche des viralen Genoms ersetzt, so dass die Viren nicht mehr replikationskompetent sind, da ihnen z. B. regulatorische Sequenzen oder die Gene für Enzyme, Kapsid- oder Hüllmembranproteine fehlen. Derartige Vektoren können sich nicht mehr selbst vermehren. Infektiöse Partikel können nur dann hergestellt werden, wenn in der Zelllinie, die die Vektoren produziert, entsprechende Informationen z. B. für die fehlenden Proteine getrennt zur Verfügung gestellt werden. Replikationsinkompetente Vektoren haben also den Vorteil, dass sie sich in der Zielzelle, die diese Informationen nicht enthält, nicht unkontrolliert vermehren können und werden daher gegenüber replikationskompetenten Vektoren bevorzugt eingesetzt. Durch Rekombination in der Verpackungszelllinie können allerdings zu einem gewissen Grad wieder replikationskompetente Viren entstehen. Um dies zu vermeiden wird das genetische Material der Viren häufig derart verändert, dass sie in möglichst vielen Hinsichten replikationsinkompetent sind. Werden die genetischen Informationen auf zwei verschiedene Plasmide verteilt, wird von einem „zwei-Plasmid-System“ gesprochen. Um die Sicherheit der Vektoren weiter zu erhöhen, werden die genetischen Informationen auch auf drei verschiedene Plasmide verteilt „drei-Plasmid-System“, die dann zur Vektorherstellung jeweils kotransfiziert werden müssen.

Anforderungen an einen viralen Vektor sind

• Sicherheit und geringe Genotoxizität
• Geringe Zytotoxizität
• Stabilität
• Zelltypspezifität

Anwendungen

Grundlagenforschung

Virale Vektoren wurden ursprünglich als Alternative zu der Transfektion von nackter DNA für molekulargenetische Experimente entwickelt. Verglichen mit traditionellen Methoden wie der Calcium-Phosphat-Transfektion kann durch die Transduktion sichergestellt werden, dass nahezu 100% der Zellen das genetische Material erhalten, ohne dass die Lebensfähigkeit der Zellen nennenswert eingeschränkt wird. Außerdem sind manche Viren und auch die von ihnen abgeleiteten Viralen Vektoren in der Lage, ihre DNA in das Genom der Zielzelle zu integrieren, so dass die Expression der DNA stabil verankert werden kann und sogar an die Tochterzellen weitervererbt werden kann. Da die Produktion von viralen Vektoren sehr aufwändig ist, sind für viele Anwendungen die sich stetig verbessernden Transfektionstechniken jedoch weiterhin die bessere Lösung.

Gene, die Proteine codieren, können mit Hilfe von viralen Vektoren exprimiert werden, um die Funktion des jeweiligen Proteins zu untersuchen. Vektoren, besonders retrovirale Vektoren, die stabile Markergene wie GFP exprimieren, werden für die permanente Markierung von Zellen eingesetzt, um sie und ihre Nachkommen verfolgen zu können. Dies geschieht beispielsweise bei Xenotransplantationen.

In den Vektor klonierte Gene, die für shRNAs und miRNAs kodieren, können für RNA-Interferenz-Experimente eingesetzt werden.

Gentherapie

Verschiedene gentherapeutische Studien sind bereits seit Beginn der 1990er Jahre durchgeführt worden, bei denen unterschiedliche virale Vektoren zum Einsatz kamen. Mit Hilfe dieser Vektoren soll das defekte Gen, bei einer monogenetischen Erbkrankheit beispielsweise das disfunktionelle ererbte Gen, durch ein gesundes ersetzt werden. Dabei ergeben sich verschiedene Schwierigkeiten je nachdem, welcher Vektor und welche Methode verwendet wird. In vitro wurden bereits große Fortschritte erzielt, bei der Anwendung im Patienten waren diese jedoch immer von Risiken begleitet, weshalb die Gentherapie noch keine breite Anwendung gefunden hat. Die Immunreaktionen des Patienten gegen den Vektor kann Komplikationen hervorrufen, so im Fall von Jesse Gelsinger, der 1999 mit einem adenoviralen Vektor behandelt wurde. Aus diesen Gründen wird es notwendig sein, für jede Krankheit, die gentherapeutisch behandelt werden soll, einen geeigneten und spezifischen viralen Vektor zu entwickeln ^[1].

Retrovirale Vektoren beispielsweise integrieren ihre Genome in das Genom der Wirtszelle. Dabei geschieht die einzelne Integration an einer zufälligen Stelle im Genom, insgesamt werden jedoch je nach Virustyp bestimmte Stellen wie aktive Gene bei HIV oder Promotorregionen bei MLV stark bevorzugt. An diesen Integrationsorten kann das Virusgenom Gene der Wirtszelle unterbrechen oder natürlicherweise stillgelegte Gene aktivieren, wobei man annimmt, dass dies je nach Integrationsmuster des jeweiligen Virus mehr oder weniger häufig geschieht. Dies kann zur Entartung der Zelle und damit zur Tumorbildung führen, so geschehen in einer Gentherapie-Studie von Severe Combined Immunodeficiency (SCID), die 1999 in Frankreich durchgeführt wurde. Vier der 10 behandelten Kinder entwickelten Leukämien infolge der Behandlung ^[2].

Impfstoffe

Viren, die DNA von Pathogenen tragen, werden derzeit als Impfstoffe gegen diese Pathogene getestet. Der virale Vektor bringt die DNA des Pathogens in die Zelle, wo sie exprimiert wird. Die Technik ist dadurch eine Erweitung der DNA-Impfung.

Geschichte

Paul Berg benutzte 1976 ein modifiziertes SV40-Virus, das DNA des Bakteriophagen Lambda enthielt, um in Zellkultur gehaltene Affennierenzellen zu infizieren.^[3] Seit Mitte der 1980er werden retrovirale Vektoren eingesetzt, die Markergene enthalten, um Zellen damit zu markieren und ihre Entwicklung innerhalb eines Organismus verfolgen zu können ^[4]. Dadurch wurde die Möglichkeit vorstellbar, Gene als Therapeutikum in Zielzellen einzusetzen.

Typen viraler Vektoren

Retroviren

Retroviren stehen derzeit im Zentrum der gentherapeutischen Forschung und sind aufgrund ihrer Eigenschaften die am weitesten verbreiteten Vektoren. ^[5]Rekombinante Retroviren können stabil in das Wirtsgenom integrieren und sind das derzeit einzige Instrument, um monogenetische Erbkrankheiten dauerhaft zu heilen. Knapp 300 klinische Studien wurden bisher (2007) mit retroviralen Vektoren durchgeführt. Zur Gattung Gammaretrovirus gehörende Retroviren wie das Murine Leukämievirus transduzieren vor allem sich in Teilung befindende Zellen und sind daher ungeeignet für die Transduktion ruhender Zellen wie beispielsweise Nervenzellen. Weil gammaretrovirale Vektoren das Risiko bergen, durch die starken Enhancer-Elemente in ihren LTRs potenzielle Onkongene in der Nähe ihres Integrationsortes zu aktivieren, wurden sogenannte SIN-Vektoren (von self inactivating) entwickelt, denen diese Enhancer im 3'-LTR-Bereich fehlen. Nach der Reversen Transkription und der Integration des Provirus ins Wirtsgenom fehlen diese auch im 5'-LTR-Bereich. Es konnte gezeigt werden, dass sich das Risiko einer Protoonkogenaktivierung dadurch verringert, völlig verhindert werden kann es jedoch auch bei SIN-Vektoren nicht.^{[6] [7]}

Lentiviren

Lentiviren sind eine Gattung innerhalb der Retroviren. Sie können im Gegensatz zu Gammaretroviren auch ruhende Zellen infizieren und haben daher ein potenziell breiteres Anwendungsspektrum. Die komplexere Biologie der Lentiviren ist der Grund, warum die Entwicklung von Vektoren aus Lentiviren schwieriger ist und weshalb diese Vektoren erst nach längerer Vorlaufzeit brauchbare Ergebnisse wie beispielsweise hohe Titer lieferten. ^[8] Nach einer im November 2006 publizierten ersten klinischen Studie, bei der lentivirale Vektoren zum Einsatz kamen, um die Replikation von HIV-1 in Patienten mit Aids zu unterdrücken, wurde positive Bilanz gezogen ^[9]. Auch von lentiviralen Vektoren wurden SIN-Vektoren erzeugt^[10], die einen wichtigen Fortschritt für die Sicherheit bedeuten. ^[11]

Foamyviren

Foamyviren sind eine Unterfamilie innerhalb der Retroviren. Einen Vorteil gegenüber einfachen Retroviren stellt beispielsweise das große Genom der Foamyviren dar, so dass auch größere therapeutische Gene verpackt werden können. Gegenüber Lentiviren ist vor allem die allgemeine Apathogenität der Foamyviren hervorzuheben, so dass selbst bei replikationskompetenten Vektoren von einer geringen Gefahr auszugehen ist. Auch weitere biologische Eigenschaften, wie z. B. dass bei der Integration weniger als bei MLV oder HIV aktive Gene bzw. Transkriptionsstartstellen bevorzugt werden, haben in letzter Zeit das Interesse der Wissenschaft an Foamyviren als Vektoren geweckt. Ein Problem stellt allerdings beispielsweise die mangelnde Pseudotypisierbarkeit der Foamyviren dar.

Adenoviren

Anders als die Lentiviren integrieren Adenoviren nicht in das Genom der Zelle und werden auch nicht während der Zellteilung repliziert. Ihr Einsatz für die Grundlagenforschung ist daher limitiert. Ihr Hauptanwendungsbereich liegt in der Gentherapie, wenn nur eine vorübergehende Expression des Zielgens gewünscht ist. Dies ist bei gentherapeutischen Ansätzen in der Tumorbekämpfung der Fall.

Quellen

1. ↑ Pagès JC, Bru T.: Toolbox for retrovectorologists. J Gene Med. 2004 Feb;6 Suppl 1:S67-82. PMID 14978752
2. ↑ Pressemitteilung der European Society of Gene Therapy (ESGT) zum vierten Leukämiefall
3. ↑ Goff SP and Berg P.: Construction of hybrid viruses containing SV40 and lambda phage DNA segments and their propagation in cultured monkey cells. Cell.(1976) 9:695-705. PMID 189942
4. ↑ Mann R, Mulligan RC, Baltimore D.: Construction of a retrovirus packaging mutant and its use to produce helper-free defective retrovirus. Cell. 1983 May;33(1):153-9.PMID 6678608
5. ↑ Bushman FD: Retroviral integration and human gene therapy. J Clin Invest. 2007 Aug;117(8):2083-6. PMID 17671645
6. ↑ Modlich U, Bohne J, Schmidt M, von Kalle C, Knöss S, Schambach A, Baum C.: Cell-culture assays reveal the importance of retroviral vector design for insertional genotoxicity. Blood. 2006 Oct 15;108(8):2545-53. Epub 2006 Jul 6. PMID 16825499
7. ↑ Zychlinski D, Schambach A, Modlich U, Maetzig T, Meyer J, Grassman E, Mishra A, Baum C.: Physiological Promoters Reduce the Genotoxic Risk of Integrating Gene Vectors. Mol Ther. 2008 Feb 19; PMID 18388936
8. ↑ Kafri T.: Gene delivery by lentivirus vectors. An overview Methods Mol Biol. 2004;246:367-90. Review. PMID 14970605
9. ↑ Kohn, Donald B: Lentiviral vectors ready for prime-time Nat Biotechnol. 2007 Jan;25(1):65-6. PMID 17211402
10. ↑ Iwakuma T, Cui Y, Chang LJ.: Self-Inactivating Lentiviral Vectors with U3 and U5 Modifications Virology. 1999 Aug 15;261(1):120-32. PMID 10441560
11. ↑ Qing Yang, Aurore Lucas, Sodany Son and Lung-Ji Chang: Overlapping enhancer/promoter and transcriptional termination signals in the lentiviral long terminal repeat Retrovirology 2007, 4:4doi:10.1186/1742-4690-4-4

Literatur

• Gary L. Buchschacher, Jr. : Lentiviral Vector Systems for Gene Transfer Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York 2003. ISBN 0-306-47702-5
• Curtis A. Machida (Hrsg.):Viral Vectors for Gene Therapy. Methods and Protocols Humana Press, 2002. ISBN 978-1588290199

Weblinks

• Virus Vectors & Gene Therapy: Problems, Promises & Prospects