Cryo-EM

Transmissions-elektronenmikroskop (TEM)

Ein Elektronenmikroskop ist ein Mikroskop, welches das Innere oder die Oberfläche einer Probe mit Elektronen abbilden kann.

Da schnelle Elektronen eine sehr viel kleinere Wellenlänge als sichtbares Licht haben (→Materiewellen) und die Auflösung eines Mikroskops durch die Wellenlänge begrenzt ist, kann mit einem Elektronenmikroskop eine deutlich höhere Auflösung (derzeit etwa 0,1 nm) erreicht werden als mit einem Lichtmikroskop (etwa 200 nm). Während bei optischen Mikroskopen die Auflösung tatsächlich nahezu die von der Lichtwellenlänge gesetzte physikalische Grenze erreicht, verschlechtern bei Elektronenmikroskopen die Aberrationen der elektronenoptischen Bauteile die nutzbare Auflösung um etwa zwei Größenordnungen gegenüber der Elektronenwellenlänge, die für 100 keV Elektronenenergie etwa 0,0037 nm beträgt.

Bei der Interpretation der mit Elektronenmikroskopen erhaltenen Daten, besonders Abbildungen, muss immer berücksichtigt werden, wie die Signale entstehen, um keine fehlerhaften Schlüsse zu ziehen.

Aufbau

Die Hauptbestandteile eines Elektronenmikroskops sind:

• Die Elektronenkanone, die die freien Elektronen in einer Elektronenquelle erzeugt und in Richtung einer ringförmig um die Strahlachse liegenden Anode beschleunigt. Zwischen Anode und Kathode liegt eine Hochspannung, die, je nach Mikroskop, von wenigen kV bis zu 3 MV variiert.
• Elektronenlinsen, die die Flugbahnen der Elektronen ablenken können. Meistens werden magnetische Linsen verwendet, in der Elektronenkanone zum Teil auch elektrostatische. Elektronenlinsen haben die gleiche Funktion wie Glaslinsen im Lichtmikroskop. Während die Brennweite der Glaslinsen fest liegt, ist sie bei Elektronenlinsen regelbar. Deshalb enthält ein Elektronenmikroskop im Gegensatz zu einem Lichtmikroskop keine austauschbaren oder verschiebbaren Linsen(systeme) wie etwa das Objektiv beziehungsweise das Okular eines Lichtmikroskops. Neben Linsen kommen wie beim Lichtmikroskop auch Blenden zum Einsatz.
• Das Vakuumsystem, das dafür sorgt, dass die Elektronenquelle effizienter arbeiten kann und die Elektronen auf ihrem Weg nicht durch Kollision mit Gasmolekülen oder Schwebeteilchen (Staub) behindert werden.
• Die Probenhalterung, die eine stabile Lage der Probe garantieren muss. Daneben sind oft Manipulationsmöglichkeiten erwünscht, von denen je nach Art des Probenhalters unterschiedliche Kombinationen realisiert werden: Verschiebung, Drehung, Verkippung, Heizung, Kühlung, Dehnung etc.
• Detektoren, die die Elektronen selbst oder sekundäre Signale registrieren.

Betriebsarten

Elektronenmikroskope lassen sich nach zwei grundsätzlichen Gesichtspunkten einteilen.

• Der erste ist die Art der Bilderzeugung:
  • Sekundärelektronenmikroskope (SEM) erzeugen mit einem elektronenoptischen System elektromagnetischer und elektrostatischer Linsen einen feinen Elektronenstrahl auf dem Objekt, der zeilenweise über den zu untersuchenden rechteckigen Objektbereich geführt wird ("gerastert, deshalb auch die Bezeichnung „Rasterelektronenmikroskop“, „REM“). Das Bild kommt dabei durch die synchrone Registrierung eines charakteristischen Signals, verursacht durch vom Objekt ausgesandte Sekundärelektronen, zustande.
  • Ruhebildmikroskope bestrahlen einen Objektbereich mit einem feststehenden, breiten Elektronenstrahl. Das Bild wird hier erzeugt, indem ein Teil der vom Objekt ausgehenden Elektronen zur Bilderzeugung mittels eines elektronenoptischen Systems verwendet wird.

• Die zweite Einteilungsmöglichkeit bezieht sich auf die Geometrie der Anordnung.
  • In Transmission („Transmissionselektronenmikroskop“, „TEM“) wird gearbeitet, indem die schnellen Strahlelektronen nach Durchgang durch das Objekt zur Bilderzeugung verwendet werden, wobei in der Regel nur sehr kleine Streuwinkel erfasst werden. Transmissionselektronenmikroskope arbeiten meistens nach der Ruhebildmethode (TEM), gelegentlich wird hierbei die Rastermethode angewendet („STEM“ von englisch „scanning transmission electron microscopy/microscope“).
  • Für das Gegenteil, die Registrierung von Elektronen, die in sehr großen Winkeln zum einfallenden Elektronenstrahl austreten, gibt es keine feststehende Bezeichnung, in der folgenden Tabelle, die die gegebene Einteilung verdeutlicht, steht dafür o.B.d.A. Rückstreuung.

	Ruhebild-EM	Raster-EM
Transmission	TEM	STEM
Rückstreuung	Reflexionsmikroskop	REM (engl. SEM)

Die nach der Anzahl von installierten Geräten häufigsten Elektronenmikroskope sind die REM/SEM, gefolgt von TEM. Noch weniger findet man STEM, wobei aber häufig der STEM-Modus als Betriebsart in TEM möglich ist, reine STEM-Geräte (engl. dedicated STEM) sind ausgesprochen selten. Reflexionsmikroskope sind nach Wissen des Autors nur als Laboraufbauten in einigen Instituten zu finden, aber nicht kommerziell erhältlich. Die Reflexionsmikroskopie, d.h. elektronenoptische Abbildung von Oberflächen, wird z.B. bei Kurzzeitexperimenten, bei denen der Elektronenstrahl nur für sehr kurze Zeiten zur Verfügung steht, eingesetzt; die kurze Zeitspanne würde nicht ausreichen, das Bildfeld in einer Weise wie beim REM mit einem Elektronenstrahl abzufahren.

Darüber hinaus gibt es noch das Feldelektronenmikroskop, das ohne eine abbildende Optik arbeitet, und in dem die Probe selbst die Kathode bildet, aus der die Elektronen austreten.

Rasterelektronenmikroskop

REM-Aufnahme einer Tarsuskralle einer Pfirsichblattlaus in einem Philips XL 20

Beim Rasterelektronenmikroskop (REM) (oder englisch SEM,Scanning electron microscope) wird ein dünner Elektronenstrahl über das üblicherweise massive Objekt gerastert. Dabei werden die aus dem Objekt wieder austretende oder rückgestreute Elektronen, oder auch andere Signale, synchron detektiert, der registrierte Strom bestimmt den Intensitätswert des zugeordneten Bildpunktes. Meist werden die Daten auch sofort auf Monitoren dargestellt, sodass man den Bildaufbau in Echtzeit verfolgen kann. Bei alten REM ohne Rechneranbindung wurde mit der Signalintensität eine Kathodenstrahlröhre direkt angesteuert, zur Bildspeicherung wurde dann das auf dem Leuchtschirm dieser Röhre geschriebene Bild mit einer Fotokamera bei entsprechend langer Verschlußöffnungszeit photographiert.

Die wichtigsten im REM zur Abbildung der Objektoberfläche genutzten Signale sind Sekundärelektronen (SE) und Rückstreuelektronen (BE oder BSE vom engl. Back Scattered Electrons). Das Kathodolumineszenz (KL)-Signal (oder CL vom engl. cathodoluminescence) ist von untergeordneter Bedeutung und wird nur in speziellen Untersuchungen angewandt.

Bei den SE handelt es sich um niederenergetische Elektronen, welche durch den Primärelektronenbeschuss freigesetzt werden. Damit ist eine sehr hohe Auflösung möglich. Sie werden durch eine Saugspannung in Richtung des Detektors beschleunigt und erzeugen dort eine ihrer Menge entsprechende Anzahl von Impulsen. Je nach Positionierung des Detektors in der Objektkammer wird ein unterschiedliches Bild erzeugt. Der Standard SE-Detektor ist seitlich über dem Objekt angebracht und liefert ein sehr natürliches, räumlich wirkendes Bild, weil die dem Detektor zugewandte Seite heller ist, als die abgewandte. Früher nannte man ein REM, das nur in dieser Betriebsart arbeitete, Sekundärelektronenmikroskop. Ein weiterer bei modernen REM vorhandener SE-Detektor ist der sogenannte „Inlens“-Detektor, der ringförmig oberhalb des Objekts im Inneren der Säule angebracht ist. Er ermöglicht aufgrund des sehr geringen Arbeitsabstands sehr hoch aufgelöste Bilder (wenige Nanometer) bei geringen Beschleunigungsspannungen des Primärstrahls (einige 100 Volt).

Die BE oder BSE sind Elektronen aus dem Primärstrahl, die an den getroffenen Atomkernen der Objektoberfläche elastisch reflektiert werden. Die Energie der Elektronen liegt dabei im Bereich der eingestrahlten Primärelektronen, die Bildauflösung liegt je nach Primärenergie im Mikrometerbereich. Der BSE-Detektor ist in der Regel als 4-Quadranten-Halbleiter-Detektor direkt oberhalb des Objekts platziert. Abhängig von der Beschaltung der Halbleiterkristalle erhält man unterschiedliche Topographiekontraste, wobei tiefliegende Bereiche des Objekts dunkel erscheinen. Die Eigenschaft, dass schwere Elemente die Elektronen stärker reflektieren als leichte, macht man sich mit dem sogenannten Z-Kontrast (Z = Ordnungszahl der Elemente) zunutze. So lässt die Helligkeit des Bildbereichs Rückschlüsse auf die chemische Natur der Objektoberfläche zu.

Als KL bezeichnet man die durch Elektronenbeschuss ausgelöste Lumineszenz der Objektoberfläche. Das KL-Signal, d.h. das sichtbare Licht, wird über spezielle Spiegel und Lichtleiter aus der Objektkammer herausgeführt, mittels Monochromator spektral zerlegt und über einen Photomultiplier oder einen CCD-Detektor detektiert.

Eine weitere, derzeit stark an Bedeutung gewinnende Untersuchungsmethode am REM, die jedoch nicht die Objektoberfläche abbildet, ist das EBSD-Verfahren (engl. Electron Back Scatter Diffraction). Mit Hilfe von EBSD kann man die kristallographische Orientierung von Kristallen an der Objektoberfläche bestimmen. Dies ist z.B. zur Charakterisierung von Materialeigenschaften in der Werkstoffwissenschaft und Geologie von großer Bedeutung. Hierzu werden die von den Kristallflächen des Objekts reflektierten Elektronen auf einen Detektorschirm projiziert und die so entstehenden Kikuchi-Linien mit Hilfe eines Computers analysiert und kristallographischen Richtungen zugeordnet.

Die Elektronenmikrosonde ist ein spezielles Rasterelektronenmikroskop, das darauf optimiert ist, chemische Analysen an Oberflächen im µm-Bereich durchzuführen. Hier kommt das wellenlängendispersive (WDX) oder das energiedispersive (EDX) Röntgenanalyse-Verfahren zur Anwendung.

Ein ESEM (engl. Environmental Scanning Electron Microscope) erlaubt es, mit einem relativ hohen Gasdruck (einige Dutzend mbar) in Objektnähe zu arbeiten. Dadurch ist es möglich, auch feuchte Objekte (z.B. lebende Zellen oder wachsende Kristalle) zu untersuchen.

Transmissionselektronenmikroskop

Strahlengang im TEM mit kristallinem Objekt, vereinfacht dargestellt. Das Abbildungssystem ist zweistufig (Objektiv und 1 Projektiv) und erzeugt daher im Abbildungsmodus zwei Beugungs- und zwei Ortsraumbilder. Wird die Projektivlinse geringer angeregt (Erhöhung der Brennweite), dann verschiebt sich das zweite Beugungsbild nach unten und kann am Detektor registriert werden (Beugungsmodus).

Beim Transmissionselektronenmikroskop (TEM) durchstrahlen die Elektronen das Objekt, das zu diesem Zweck entsprechend dünn sein muss. Je nach Ordnungszahl der Atome, aus denen das Objektmaterial besteht, der Höhe der Beschleunigungsspannung und der gewünschten Auflösung kann die sinnvolle Objektdicke von wenigen Nanometern bis zu einigen Mikrometern reichen. Je höher die Ordnungszahl und je niedriger die Beschleunigungsspannung sind, desto dünner muss das Objekt sein.

Durch eine Änderung des Projektivlinsensystems kann anstatt des Zwischenbildes auch die Fokusebene (Brennebene) der Objektivlinse vergrößert abgebildet werden (siehe Abbildung). Man erhält ein Elektronenbeugungsbild, mit dessen Hilfe sich die Kristallstruktur des Objekts bestimmen lässt.

Das Transmissionselektronenmikroskop kann sinnvoll mit verschiedenen Analysemethoden erweitert werden, besonders verbreitet sind Energiedispersive Röntgenanalyse (EDA, engl. Energy-Dispersive X-ray Analysis, EDX) sowie Elektronen-Energieverlust-Spektroskopie (engl. Electron Energy Loss Spectroscopy, EELS). Beide Verfahren können zur Bestimmung der Konzentration und Verteilung chemischer Elemente in der Probe benutzt werden, wobei auch hier die kleinen erzielbaren Durchmesser des Elektronenstrahls prinzipiell die Untersuchung sehr kleiner Objektbereiche gestattet. Man spricht beim Einsatz dieser Methoden oft von analytischer Transmissionselektronenmikroskopie.

Eine Weiterentwicklung der Elektronen-Energieverlust-Spektroskopie-Verfahren im TEM stellt die Energiegefilterte Transmissionselektronenmikroskopie (EFTEM) dar, bei der meist Bilder aus inelastisch gestreuten Elektronen bestimmter, charakteristischer Energien aufgezeichnet werden. Damit kann die Verteilung von chemischen Elementen im Bildfeld oft sehr schnell und effektiv bestimmt werden. Analog dazu können auch energiegefilterte Elektronenbeugungsbilder aufgenommen werden.

Wird der Primärelektronenstrahl fein gebündelt über das Objekt gerastert, die durchgelassenen Elektronen detektiert und der jeweiligen Strahlposition auf dem Objekt zugeordnet, so bezeichnet man dieses Verfahren als Raster-Transmissionselektronenmikroskopie (STEM engl. Scanning Transmission Electron Microscope).

Optische Aberrationen

Ein Messverfahren für die optischen Fehler (Aberrationen) eines Elektronenmikroskops ist das Zemlin-Tableau. Dabei werden im Elektronenmikroskop Bilder von Kohlefolien unter verschiedenen Strahlkippungen aufgenommen. Die Power-Spektren dieser Bilder werden entsprechend dem Azimut der Strahlkippung in einem Tableau angeordnet. Mit Hilfe dieses Tableaus können alle paraxialen Aberrationen gemessen werden. Das Zemlin-Tableau dient somit der exakten Justierung des Elektronenmikroskops und der Korrektur der optischen Fehler. ^[1]

Objektaufbereitung

Nichtleitende Objekte mussten in der Vergangenheit, insbesondere im Rasterelektronenmikroskop (REM), zur Verhinderung einer elektrostatischen Aufladung mit einer dünnen leitenden Schicht versehen werden. Dieses wird normalerweise durch Plasmabeschichtung mit Gold in einem Sputter-Gerät oder Bedampfen mit Kohlenstoff erreicht. Inzwischen stehen durch die Verwendung von Niederdruck-Gas im Objektraum (Gerätetyp ESEM, hier transportieren Gasmoleküle Oberflächenladungen fort) bzw. die Nutzung sehr niederenergetischer Primärelektronen (dank ausgeklügelter Elektronenoptiken; hier wird der Summen-Elektronenstrom an der Probe nahe 0 eingestellt) Möglichkeiten zur Verfügung, nichtleitende Objekte ohne leitende Beschichtung abzubilden.

Für die Transmissionselektronenmikroskopie müssen die Objekte mit unterschiedlichen Verfahren auf eine maximale Dicke von 100 nm (in besonderen Fällen 1 µm) gebracht werden. Sehr gebräuchlich ist das Ionenätzverfahren, bei dem das Objekt durch einen Ionenstrahl erodiert wird.

Nachteile

Die aufwändige Vorbereitung der Objekte kann zu Artefakten führen - Strukturen, die nur durch die Vorbereitung entstanden sind, und nichts mit dem eigentlichen Objekt zu tun haben -, was die Auswertung der Bilder erschwert. Darüber hinaus können im REM die Materialeigenschaften von denen kompakter Objekte abweichen, durch den überproportionalen Anteil oberflächennaher Bereiche am Analytvolumen. Ein weiteres Problem ist die Schädigung der Objekte durch den Elektronenstrahl, beispielsweise durch Erwärmung oder Wegstoßen ganzer Atome nach Kollision mit den schnellen Elektronen, aber auch Einschuss von Fremdatomen aus dem Vakuum in die Probe. Durch das im Inneren des Mikroskops herrschende Vakuum, die zum Herstellen eines Präparates nötige Trocknung und Fixierung, sowie das unverzichtbare äußerst feine Schneiden des Präparates machen es (außer mit dem ESEM) unmöglich, ein lebendes Objekt zu mikroskopieren.

Als weiterer Nachteil können die sehr hohen Anschaffungs- und Unterhaltskosten für Elektronenmikroskope angesehen werden, die es Privatunternehmen oft nicht erlauben, eigene Geräte zu betreiben. Daher sind Elektronenmikroskope überwiegend in Forschungsinstituten und in Dienstleistungsunternehmen anzutreffen.

Geschichte

Die erste auf magnetischen Kräften beruhende Linse wurde 1926 von Hans Busch entwickelt. Als erstes Elektronenmikroskop wurde 1931 ein TEM von Ernst Ruska und Max Knoll gebaut, wenngleich zunächst keine elektronentransparenten Objekte, sondern testweise kleine Metallgitter abgebildet wurden. Für diese Arbeit erhielt Ruska 1986 den Physik-Nobelpreis. Er entwickelte auch bei Siemens 1938 das erste kommerzielle Elektronenmikroskop.

Die Kontrastierung biologischer Objekte mit Osmiumsäure schlug Ladislaus Marton 1934 vor. Das erste STEM wurde 1937 von Manfred von Ardenne gebaut.

Während in den frühen Jahren die Aufklärung der lichtmikroskopisch unsichtbaren Krankheitserreger (Viren) eine bedeutende Triebfeder für die Entwicklung des Elektronenmikroskops war, erweiterte sich das Interesse später besonders auf die Materialwissenschaft, nachdem Robert D. Heidenreich 1949 die Präparation dünner durchstrahlbarer Metallfolien gelang.

In den 1960er Jahren entwickelte man TEM mit immer höherer Beschleunigungsspannung (bis zu 3 MV, um 1965 in Toulouse, 1970 in Ōsaka), vor allem um dickere Objekte durchstrahlen zu können. In diesem Jahrzehnt wurde auch erstmals atomare Auflösung erreicht.

Ende der 1960er führte Albert Crewe den Feldemitter für STEM ein und verhalf dieser Technik damit erst zu ihrer Bedeutung.

Ende der 1980er Jahre wurde das ESEM entwickelt. Seit Ende der 1980er Jahre werden Schottky-Feldemitter in TEM eingesetzt. Seit Anfang der 1990er Jahre kommen FESEM mit Schottky-Feldemitter zum Einsatz.

Erwähnenswert ist auch der zunehmende Einsatz von Computern seit den 1990er Jahren. So lassen sich beispielsweise komplizierte Linsensysteme automatisch durch Analyse der Aufnahmen einer CCD-Kamera justieren, was den Benutzer des Mikroskops deutlich entlastet. Unabdingbar ist der Einsatz von Computern zur Kompensation von Aberrationen der elektronenoptischen Linsen mit magnetischen Multipollinsen, eine Technik, die in den letzten Jahren sowohl im REM, TEM, wie auch im STEM-Bereich immer mehr Bedeutung erlangt.

Anfang 2008 wurde ein neues Transmissionselektronenmikroskop mit Aberrationskorrektur, „TEAM“ genannt, angekündigt^[2]. Es weist eine Auflösung von 0,05 Nanometern auf ^[3][4].

Im Dezember 2008 wurde vom Forschungszentrum Jülich der Bau eines 15 Millionen Euro teueren Elektronenmikroskops am Ernst Ruska-Centrum für Mikroskopie und Spektroskopie angekündigt. Mit einer Auflösung von ebenfalls 0,05 Nanometern wird es zu den auflösungsstärksten Mikroskopen der Welt gehören.^[5][6]

Siehe auch

• Rastertunnelmikroskop
• Feldionenmikroskop

Weblinks

• electron microscopy Webseite der ETH Zürich: sehr gute Grafiken und Abbildungen, die verschiedene Verfahren illustrieren.
• elektronenmikroskopischer Atlas von Zellen, Organen und Geweben von Säugetieren

Literatur

• Stanley L. Flegler, John W. Heckman jr., Karen L. Klomparens: Elektronenmikroskopie: Grundlagen, Methoden, Anwendungen. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford 1995, ISBN 3-86025-341-7
• Ludwig Reimer, Gerhard Pfefferkorn: Raster-Elektronenmikroskopie. 282 Seiten - 2., erw. Auflage. Springer, Berlin 1999, ISBN 3-540-08154-2.
• David B. Williams and C. Barry Carter: Transmission Electron Microscopy - A Textbook for Material Sciences. 729 Seiten - Plenum Press, New York, London 1996, ISBN 0-306-45247-2.

Einzelnachweise

1. ↑ F. Zemlin, K. Weiss, P. Schiske, W. Kunath und K.-H. Herrmann, Ultramicroscopy 3 (1978) 49-60
2. ↑ http://ncem.lbl.gov/TEAM-project/files/TEAM0.5.html
3. ↑ http://www.weltderphysik.de/de/4245.php?ni=801
4. ↑ TEAM Project Achieves Microscopy Breakthrough. FEI Company. Abgerufen am 25. März 2008. (englisch)
5. ↑ Stärkstes Mikroskop der Welt. Abgerufen am 14. Dezember 2008.
6. ↑ Stärkstes Mikroskop der Welt kommt nach Jülich. Abgerufen am 14. Dezember 2008.

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