Reversed Phase

Chromatografie oder Chromatographie (griechisch, zu deutsch Farbenschreiben) wird in der Chemie ein Verfahren genannt, das die Auftrennung eines Stoffgemisches durch unterschiedliche Verteilung seiner Einzelbestandteile zwischen einer stationären und einer mobilen Phase erlaubt. Dieses Prinzip wurde erstmals 1901 von dem russischen Botaniker Michail Semjonowitsch Tswett beschrieben, 1903 wurde es zum ersten Mal öffentlich gedruckt beschrieben, 1906 benutzte er erstmals den Begriff „Chromatografie“. Er untersuchte gefärbte pflanzliche Extrakte, zum Beispiel aus Blattmaterial, und konnte daraus durch Chromatografie verschiedene Farbstoffe isolieren. Praktische Anwendung findet diese Methode zum einen in der Produktion zur Isolierung oder Reinigung von Substanzen (= präparative Chromatografie), zum anderen in der chemischen Analytik, um Stoffgemische in möglichst einheitliche Inhaltsstoffe zwecks Identifizierung oder mengenmäßiger Bestimmung aufzutrennen. Die Chromatografie ist aus der heutigen organischen Chemie, der Biochemie, der Biotechnologie, der Mikrobiologie, der Lebensmittelchemie, der Umweltchemie und auch der anorganischen Chemie nicht mehr wegzudenken.

Prinzip der Chromatografie

Zusammenhänge in der Chromatografie und Vergleiche

Die Chromatografie lässt sich am einfachsten durch einen Vergleich erklären:

Ein reißender Fluss kann einiges an Treibgut mit sich führen. Die Geschwindigkeit, mit der das Treibgut weiterbewegt wird, hängt ab

• von der Art des Treibguts (Sandkörner werden schneller als Kieselsteine transportiert),
• von der Beschaffenheit des Flussbetts (raue Oberflächen erhöhen die Reibung des Treibguts und verringern somit die Geschwindigkeit des Abtransports) und
• von der Strömungsgeschwindigkeit.

In der Chromatografie werden unterschiedliche Substanzen (= Treibgut) in der so genannten Mobilen Phase (= Wasser) auf einer Stationären Phase (= Flussbett) befördert. Aufgrund der Wechselwirkungen (siehe die Einteilung unter Trennprinzipien) zwischen der Probe, der stationären Phase und der mobilen Phase werden einzelne Substanzen unterschiedlich schnell weitertransportiert und werden somit voneinander getrennt: Ein Gemisch aus Sand, sehr kleinen und etwas größeren Kieselsteinen wird an einer Stelle des Flusses eingebracht; nach beispielsweise hundert Metern kommt zuerst der gesamte Sand an (verteilt auf ein paar Meter) und nach einer gewissen Wartezeit kommen alle kleineren Kieselsteine und noch viel später die größeren, jeweils auf eine gewisse Strecke auseinandergezogen.

Dieser Vergleich eignet sich für einen ersten Einstieg. Tatsächlich erinnert der Prozess (bei der Chromatografie) eher an einen „digitalen“ Prozess (stop and go). Die Probemoleküle werden entweder mit der mobilen Phase mitgenommen (mit der Geschwindigkeit der mobilen Phase – Analogie wäre ein Floß, das passiv in einem Strom mitgeführt wird) oder sie haften an der stationären Phase (Geschwindigkeit gleich Null). Zwischen diesen beiden Möglichkeiten wechseln sie sehr rasch hin und her (aufgrund der Wärmebewegung erhalten sie ständig Stöße). Der Vergleich mit dem Flussbett könnte auch zu einem weiteren Missverständnis führen: die Verzögerungen, die die verschiedenen Probemoleküle auf dem Weg durch das chromatografische System erleiden, haben nichts mit Reibungsphänomenen zu tun. Basis für das Verständnis sind Unterschiede in der Verteilung (der verschiedenen Molekülsorten A, B, C usw.). Sie entsprechen Unterschieden im Zeitanteil (den die einzelnen Moleküle vom Typ A, B, C usw. im Mittel in der mobilen Phase verbringen). Die Chromatografie schafft es, diese Unterschiede in Geschwindigkeitsunterschiede zu verwandeln und damit für eine Trennung gut nutzbar zu machen. Das könnte man auch als den „Trick“ oder als das Prinzip der Chromatografie bezeichnen. Ansonsten wären diese oft recht kleinen Unterschiede kaum zu nutzen, weder für Trenn- und Reinigungsprozesse noch für Analysen.

Anhand eines Beispiels ist es leichter zu verstehen: Wenn sich 45 % der A-Moleküle in der mobilen Phase aufhalten (im Mittel), kommt es auf Grund des dynamischen Gleichgewichtes dazu, dass die individuellen A-Moleküle auch 45 % der Zeit in der mobilen Phase verbringen (im Mittel). Daher wird ihre Geschwindigkeit 45 % der Geschwindigkeit der mobilen Phase betragen (im Mittel). Für gute Ergebnisse bei der Chromatografie ist es entscheidend, dass der Stoffaustausch zwischen den beiden Phasen sehr rasch erfolgt, das heißt die einzelnen Probemoleküle sollen sehr oft zwischen den beiden Phasen hin und her wechseln (Diffusionsprozesse, Wärmebewegung). Eine Voraussetzung dafür ist, dass die Wege, die die Moleküle von der stationären Phase zur mobilen Phase zurückzulegen haben, sehr kurz sind. Falls die stationäre Phase ein Pulver enthält, sollte die Korngröße dieses Pulvers sehr klein sein (zum Beispiel nur wenige Mikrometer). Aus bestimmten Gründen sollten die Pulverkörner auch möglichst einheitlich geformt sein und eine möglichst einheitliche Größe aufweisen (enge Korngrößenverteilung).

Prozess

Schematische Darstellung

Für die Chromatografie sind die Herstellung des Flusses der mobilen Phase, die Injektion der zu trennenden Probe, die eigentliche Trennung und die Detektion nötig. Das Fließen der mobilen Phase wird entweder mittels Druck (hydraulischen Pumpe, Gasdruck), Kapillarkraft oder durch Anlegen einer elektrischen Spannung erreicht.

Die Injektion (= Einbringen des Substanzgemisches in das chromatografische System) erfolgt entweder, bevor der Fluss der Mobilen Phase hergestellt wird (z. B. Dünnschichtchromatografie) oder während die Mobile Phase bereits fließt. Bei einer großen Anzahl von Proben werden bei automatisierbaren Chromatografiearten sogenannte Autosampler (zusammen mit eigenen Datenerfassungssystemen) eingesetzt, die vollautomatisch die Proben injizieren.

Anschließend erfolgt die eigentliche Auftrennung des Substanzgemisches auf der Trennstrecke. Ohne Detektion (= sichtbar machen, wann eine Substanz einen bestimmten Teil des Chromatografiesystems passiert oder wo eine Substanz nach dem Beenden des Prozesses zum Liegen kommt) ist eine Chromatografie nicht denkbar. Für jede Chromatografieart werden verschiedene Detektionsysteme eingesetzt, indem entweder physikalische Eigenschaften (Absorption von Licht, Fluoreszenz, Lichtstreuung, Wärmeleitfähigkeit .) der Substanzen ausgenutzt werden oder durch chemische Reaktionen ein Signal erhalten wird. Mittels chemischer Reaktionen wird z. B. eine Färbung bei der planaren Chromatografie erreicht (z. B. Aminosäuren mittels Ninhydrin) oder Reaktionen vor dem Auftrennen (Vorsäulenderivatisierung) oder nach dem Auftrennen (Nachsäulenderivatisierung) bei der Säulenchromatografie durchgeführt.

Bei der präparativen Chromatografie wird anschließend noch ein Fraktionensammler zum Auffangen der aufgetrennten Substanz benötigt.

Bauartbedingt handelt es sich bei chromatografischen Aufreinigungsverfahren immer um Batch-Verfahren. Dies bedeutet, dass immer nur eine bestimmte Menge an Substanz aufgetragen und getrennt werden kann, bevor mit der nächsten Menge fortgefahren werden kann. Dies ist insbesondere bei der Aufarbeitung großer Mengen problematisch, so dass einige Verfahren entwickelt wurden, um Chromatografie kontinuierlich betreiben zu können: Annulare Chromatografie, TMB (True Moving Bed) Chromatografie und SMB-(Simulated Moving Bed) Chromatografie.

Begrifflichkeiten und Prinzip

Stationäre Phase

Phase, die mit den einzelnen Substanzen des Substanzgemisches Wechselwirkungen eingeht und sich nicht bewegt. Der Aufenthalt der Analyten bei ihrer Retention wechselt zwischen mobiler und stationärer Phase (random walk), und verursacht die substanzcharakteristische Retentionszeit. Die stationäre Phase besteht in der Gaschromatografie aus einer flüssigen, hochviskosen Substanz, mit welcher die Innenseite der Kapillare beschichtet ist. Bei der Flüssigchromatografie ist die stationäre Phase normalerweise fest.

Mobile Phase

Phase, in die das Substanzgemisch am Beginn des Trennsystems eingebracht und die bewegt wird. Bei der Flüssigchromatografie ist die mobile Phase gasförmig oder flüssig. Bei der Gaschromatografie kommen Trägergase wie Wasserstoff, Helium oder Stickstoff zum Einsatz. Mobile Phasen unterscheiden sich in ihrer Elutionsfähigkeit („Stärke“ s. u. „Elutrope Reihe“), dies bedingt unterschiedliche Retentionszeiten und oft auch unterschiedliche Selektivitäten.

Retention

Verzögerung von einzelnen Substanzen des Substanzgemisches durch Wechselwirkung mit der stationären Phase.

Die Retention einer Substanz durch die stationäre Phase wird im wesentlichen durch drei Aspekte bestimmt:

• Stärke der Wechselwirkung der Substanz mit der stationären Phase („Neigung in der stationären Phase zu bleiben“)
• Siedepunkt der Substanz („Neigung in der mobilen Phase zu bleiben“)
• Diffusionseigenschaften der Substanz („Beweglichkeit in der stationären und mobilen Phase“)

In vielen Fällen wird gezielt eine spezielle Wechselwirkung des zu analysierenden Stoffes mit der stationären Phase genutzt, um Substanzen zu trennen. Die Stärke der Wechselwirkungen zwischen den Probenkomponenten und der stationären Phase wird sowohl von deren Struktur als auch von deren funktionellen Gruppen bestimmt. Dabei treten bei unpolaren Substanzen ausschließlich Dispersionswechselwirkungen (Van-der-Waals-Bindung) auf, während polare Trennphasen auch polare Wechselwirkungen eingehen können, etwa Wasserstoffbrückenbindungen oder Donator-Akzeptor-Bindungen. Letztere trennen nach dem Prinzip: Gegensätze ziehen sich an. Das bedeutet, dass Trennphasen, die etwa Wasserstoff zur Wasserstoffbrückenbindung aufzunehmen in der Lage sind Substanzen trennen, die Wasserstoff zur Brückenbindung bereitstellen können (etwa Alkohole). Auch können zum Beispiel Enantiomere, welche sich in ihren Siedepunkten nicht unterscheiden und somit gleiche Retentionszeiten aufweisen würden, durch ihre verschieden starken Wechselwirkungen mit speziellen Derivaten von Cyclodextrinen aufgetrennt werden.

Retentionszeit

Zeit, die die Moleküle eines reinen Stoffes zum Durchwandern der Säule benötigen (von der Injektion bis zur Detektion).

Im Gegensatz zu den Trägergasen zeigen die meisten chemischen Stoffe eine Wechselwirkung mit der stationären Phase, d. h. sie halten sich für eine gewisse Zeit in der stationären Phase auf. Ihre Aufenthaltsdauer in der stationären Phase addiert sich zur Aufenthaltsdauer in der mobilen Phase (Totzeit), sie benötigen also insgesamt länger, um die ganze GC-Säule zu passieren. Ursprünglich leitet sich der Begriff Retention (Zurückhaltung) davon ab, dass die stationäre Phase den Analyten für eine gewisse Zeit zurückhält. Heutzutage wird der Begriff Retentionszeit allerdings vereinfacht verwendet für die Zeit, die der Analyt zum Passieren der Säule benötigt und dies schließt also die Totzeit mit ein. Daher werden die Begriffe folgendermaßen definiert:

• Retentionszeit [t_R]: Ist die Gesamtzeit, die ein Analyt für das Passieren der Säule benötigt. Dies entspricht der Zeit zwischen Injektion und Detektion des Analyten.
• Totzeit [t₀]: Ist die Zeit, in der sich ein Analyt ohne Wechselwirkung mit der stationären Phase in der mobilen Phase aufhält; entspricht also der Zeit, die die mobile Phase zum Durchlaufen der Säule benötigt.
• Nettoretentionszeit oder reduzierte Retentionszeit [t_N]: Ist die Differenz aus Retentionszeit und Totzeit. Sie entspricht also der Zeit, in der sich ein Analyt in der stationären Phase aufhält. t_N = t_R - t₀

Durchflusszeit (Totzeit)

Die Durchflusszeit (früher auch „Totzeit“) gibt die Zeit an, die die mobile Phase oder eine nicht zurückgehaltene Substanz benötigt, um die Chromatografie-Apparatur von der Injektion über die Säule bis zum Detektor zu durchwandern (s. a. Durchflussvolumen). Die Durchflusszeit kann bestimmt werden, indem eine nicht zurückgehaltene Substanz („Inertsubstanz“) in das HPLC-System injiziert wird. Diese Substanz geht nur in sehr geringem Maße Wechselwirkungen mit der stationären Phase ein. Sie durchläuft daher die Apparatur in derselben Zeit wie die mobile Phase. Die Durchflusszeit ist dann identisch mit der Zeit zu der der Peak im Detektor erscheint.

Durchflussvolumen

Das Durchflussvolumen kann direkt aus der Durchflusszeit abgeleitet werden. Es ergibt sich aus der einfachen Formel Durchflussvolumen = Fluss der mobilen Phase • Durchflusszeit. Das Durchflussvolumen ist für zahlreiche Berechnungen in der HPLC sehr wichtig, z. B. für den Methodentransfer zwischen Säulen mit unterschiedlichem Volumen.

Elution

Elution (von lat. eluere „auswaschen“) ist das Herauslösen oder Verdrängen von adsorbierten Stoffen aus festen oder mit Flüssigkeit getränkten Adsorbentien und Ionenaustauschern durch kontinuierliche Zugabe eines Lösungsmittels (Elutionsmittel = mobiler Phase). Die aus der Trennsäule fließende Lösung wird Eluat genannt.

Eine besondere Bedeutung hat dieser Prozess in der Festphasenextraktion.

Eluent

Mobile Phase, die die Trennstrecke passiert hat.

Eluotrope Reihe

Anordnung der als mobile Phase üblichen Lösungsmittel nach ihrer Elutionskraft bei einer Referenzsubstanz (i. d. R. Kieselgel oder Aluminiumoxid). Die Anordnung kann aufsteigend oder absteigend gewählt werden.

Bluten

Als Bluten wird ein Effekt bei Chromatographie-Säulen bezeichnet, bei dem die Säule geringe Anteile ihrer Matrix verliert. Ursache hierfür können sein in der Gaschromatographie eine übermäßige thermische Belastung der Säule und in der HPLC die Verwendung ungeeigneter pH-Werte bei den Eluenten (zu stark sauer oder alkalisch). Der Effekt bewirkt ein starkes Signalrauschen und einen hohen Hintergrundwert bei nachgeschalteten Analyseverfahren, wie einem Massenspektrometer.

Chromatografie

Säule: In der Chromatografie versteht man unter einer Säule eine hohle Röhre von einem Durchmesser von wenigen Mikrometern bis zu mehreren Metern. Diese Röhre ist entweder mit der stationären Phase komplett gefüllt (gepackte Säule) oder innen dünn beschichtet (Kapillarsäule).

Reversed Phase-Mechanismus

Bei der Adsorptionschromatografie gibt es zwei Möglichkeiten ein Substanzgemisch zu trennen:

1. Normale Phase: polare stationäre Phase (wie Kieselgel, Aluminiumoxid), unpolare bis mittelpolare mobile Phase (wie KW-Stoffe, Dioxan, Essigsäureethylester …) oder
2. Reversed Phase (Umkehrphase): unpolare stationäre Phase (wie modifiziertes Kieselgel) und polare mobile Phase (wie gepuffertes Wasser).

Im ersten Fall werden lipophile Stoffe leicht, polare schwer eluiert, im Umkehrfall polare leicht eluiert („similia similibus solvuntur“).

In der HPLC wird oft eine Gradienteneluierung angewandt (reversed phase), wobei die Zusammensetzung des Lösungsmittels langsam geändert wird (z. B. von 80 % auf 20 % Wasseranteil). So treten Alkane sehr spät und Aminosäuren sehr früh aus der Säule aus und man kann diese Fraktionen herausschneiden.

Die chromatografischen Trennmethoden lassen sich nach verschiedenen Gesichtspunkten einteilen:

Einteilung nach dem Trennprinzip

Das grundlegende Prinzip aller chromatografischen Verfahren ist die oft wiederholte Einstellung eines Gleichgewichtes zwischen einer ruhenden Phase und einer bewegten Phase. Das Gleichgewicht kann sich auf Grund verschiedener physikalisch-chemischer Effekte ausbilden.

• Adsorptions-Chromatografie – Hier kommt es zu einer Trennung der verschiedenen Komponenten auf Grund der unterschiedlich starken adsorptiven Bindungen zur ruhenden Phase. Die bewegte Phase kann ein mehr oder weniger polares Lösungsmittel oder bei gasförmigen Stoffen ein Trägergas sein. Im Fall der Flüssigchromatografie stellt man sich einen Wettkampf zwischen den diversen Probemolekülen mit den Molekülen der mobilen Phase (Fließmittel, Laufmittel) um die Haftstellen auf der (großen) Oberfläche der stationären Phase vor.
• Verteilungs-Chromatografie – Ähnlich dem Extraktionsverfahren wird hier die unterschiedliche Löslichkeit der zu trennenden Komponenten ausgenutzt. Bei der Chromatografie bleibt aber das Lösungsmittel als ruhende Phase auf einem Trägermaterial haften. Die bewegte Phase kann wieder eine Lösung oder ein Trägergas sein.
• Ionenaustauschchromatografie (siehe auch Anionenaustauschchromatografie und Kationenaustauschchromatografie) – Die bewegte Phase ist hier meist eine Lösung der zu trennenden Ionen. Die ruhende Phase ist ein fester Ionenaustauscher. Ionenaustauscher bilden zwischen den verschiedenen Ionen der bewegten Phase unterschiedlich stabile Bindungen aus.
• Siebwirkung – Bei der ruhenden Phase benutzt man Stoffe, die die Komponenten anhand ihrer Größe trennen. Im Wesentlichen unterscheidet man hier zwischen drei Verfahren.
  • Molekularsieb-Chromatografie
  • Gel-Permeations-Chromatografie (Gelfiltration)
  • Ausschluss-Chromatografie

Bei einem Sieb haben Teilchen „Vorteile“, die fein genug sind, um die Poren des Siebes zu durchdringen. Bei den entsprechenden Chromatografieverfahren ist es genau umgekehrt. Genügend feine Teilchen sind in der Lage, sich in die Hohlräume der stationären Phase zu „verirren“, sind daher langsamer unterwegs als Moleküle, die auf Grund ihrer Größe aus diesen Hohlräumen (mehr oder weniger oder zur Gänze) ausgeschlossen werden. Bei genügender Größe wandern sie unverzögert, da sie sich nur im bewegten Flüssigkeitsstrom aufhalten und nie im unbewegten Teil der Flüssigkeit (in den Hohlräumen – z. B. des Gels).

• Affinitätschromatografie – Als stationäre Phase wird eine für jeden Analyten spezifische chemische Verbindung eingesetzt, die auf Grund nichtkovalenter Kräfte eine Trennung bewirkt. Es handelt sich hierbei um eine hochselektive Methode.
  • IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) – Hierbei werden über Komplexbindungen Metallionen wie Fe, Co, Ga u. a. an eine Matrix gebunden. Die Trennung wird über die unterschiedlichen Wechselwirkungen zwischen dem Analyten und den Metallionen erreicht. Besonders bei der Aufreinigung von Proteinen durch Phosphorylierung hat sich diese Methode etabliert. Dabei werden als Metallionen vornehmlich Fe und Ga genutzt. Als Konkurrenzverfahren hat sich dort seit einiger Zeit die Anreicherung über Titandioxid-Säulen bewährt. Für die Aufreinigung von poly-Histidin-markierten Proteinen sind ebenfalls verschiedene IMAC-Verfahren. Hierbei werden vor allem Ni und Co Ionen für die Anreicherung genutzt.
• Chirale Chromatografie – Zur Trennung von chiralen Molekülen. Die stationäre Phase enthält ein Enantiomer, das mit den beiden Enantiomeren des Racemats eine unterschiedlich starke diastereomere Wechselwirkung eingeht. Die beiden Enantiomere werden unterschiedlich stark retardiert.

Einteilung nach den verwendeten Phasen

Auf Grund der mobilen Phasen kann man die Chromatografie in drei Gebiete unterteilen, welche sich nach den Trägern der stationären Phasen oder dem Aggregatzustand der stationären Phasen wieder in unterschiedlich viele Gruppen unterteilen lassen.

• Flüssigchromatografie (engl. liquid Chromatography, LC)
  • Planare Chromatografie
    • Papierchromatografie – Als feste Phase wird Papier verwendet, das entweder liegt oder (meist) senkrecht in einem Glasbehälter steht. Wie auch bei der Dünnschichtchromatografie wird die mobile Phase auf Grund der Kapillarkräfte bewegt.
    • Dünnschichtchromatografie – Als feste Phase werden z. B. Silikapartikel in einer feinen Schicht auf einer flexiblen Trägerfolie aus Aluminium oder Plastik oder einer Glasplatte aufgetragen. Eine Variante ist die zirkuläre DC, mit einer rotierenden, beschichteten Kreisscheibe (speziell für präparative Zwecke geeignet).
  • Säulenchromatografie
    • Niederdruckchromatografie – Die hier verwendeten Säulen weisen Durchmesser von einem bis mehreren Zentimetern auf. Diese Form der Flüssigchromatografie wird vor allem für präparative Trennungen eingesetzt.
    • Hochleistungschromatografie (unrichtig, jedoch sehr gebräuchlich ist auch der Ausdruck Hochdruckchromatografie; engl. HPLC High Performance (Pressure) Liquid Chromatography) – Sie stellt die heute am weitesten verbreitete in der Analytik eingesetzte Trennmethode dar, die eigentlich unkorrekte (veraltete) Bezeichnung High Pressure Liquid Chromatography bezieht sich auf die Drücke, die diese Methode von der Niederdruck- oder anderen Chromatografiearten unterscheidet. Immerhin werden hier bis zu 400 bar bei einer Flussrate der mobilen Phase bis zu 5 ml/min erzeugt, die jedoch mit der Trennleistung nicht zu tun haben, sondern nur zur Fortbewegung des Eluentengemischs in der Säule dienen.
    • Elektrochromatografie – In diesem Fall wird die Mobile Phase durch Anlegen einer Spannung bewegt. Diese Methode befindet sich noch im Entwicklungsstadium und wird im Routinebetrieb nicht angewendet. Nicht zu verwechseln mit Elektrophorese.
  • Membranchromatografie
    • Hierbei wird statt einer mit chromatografischer Matrix gefüllten Säule eine ein- oder mehrlagige Membran als feste Phase in einem entsprechenden Gehäuse eingesetzt. Die mobile Phase wird bei niedrigen Drücken bis zu 6 bar und bei etwa 20-fach höheren Flussraten als in der Säulenchromatografie üblich durch die Membran gepumpt.
• Gaschromatografie
  • Gepackte Säulen – Das Innere einer Säule (lange Röhre) ist mit einem feinkörnigem Material gefüllt. In der Regel besteht dabei die stationäre Phase aus einem dünnen Film einer weitgehend inerten und hochsiedenden Flüssigkeit, der die Pulverkörner überzieht.
  • Kapillarsäulen – Nur die Säulenwand ist mit einer dünnen Schicht aus stationärer Phase bedeckt.
    • Flüssige stationäre Phase
    • Feste stationäre Phase
• Überkritische Fluidchromatografie (engl. SFC supercritical fluid chromatography) – Als mobile Phase wird eine Substanz in ihrer überkritischen Phase (Zustand zwischen Gas und Flüssigkeit) eingesetzt. Hierbei handelt es sich meist um Kohlendioxid. Bei dieser Methode werden nur Säulen als Träger von stationären Phasen eingesetzt.

Kenngrößen der Chromatografie

• Säulenlänge L

• Durchflusszeit t₀

• Retentionszeit t_R

• u nennt man die lineare Durchflussgeschwindigkeit der mobilen Phase durch die Säule, sie ist definiert als:

$u=\frac{L}{t_0}$

• der Retentionsfaktor k ist definiert durch

$k=\frac{t_R-t_0}{t_0}$

• Der Trennfaktor α gibt die Güte der Trennung zweier Substanzen an. Er beruht auf der Retentionszeiten t_R der Komponenten in der Säule. Die Retentionszeit ist die Zeit, die die betrachtete Komponente zum Durchqueren der Säule braucht und wird am Peakmaximum abgetragen:

$\alpha= \frac{k_2}{k_1}$

• R, die chromatografische Auflösung (Resolution) zweier Peaks errechnet sich aus:

$R=2\cdot\left(\frac{t_{R2}-t_{R1}}{b_{B2}+b_{B1}}\right)$ oder

$R=1,18\cdot\left(\frac{t_{R2}-t_{R1}}{FWHM_1+FWHM_2}\right)$

Der Faktor 1,18 kommt durch das Verhältnis der Halbwertsbreite zur Basisbreite einer Gaußschen Glockenkurve ((2 · ln 2)^0,5) zustande.

• N, die Trennstufenzahl oder Bodenzahl beschreibt die Anzahl der Gleichgewichtseinstellungen, der zu trennenden Substanz zwischen stationärer und mobiler Phase, in der Säule. Je größer N, desto mehr Gleichgewichtseinstellungen können in einer bestimmten Länge erfolgen, woraus eine bessere Trennleistung der Säule resultiert. N wird berechnet mit Hilfe der Formel:

$N=16\cdot\left(\frac{t_R}{b_B}\right)^2 (2^2 \cdot 4 = 16)$ oder

$N=5,54\cdot\left(\frac{t_R}{FWHM}\right)^2 (1,18^2 \cdot 4 = 8 \cdot ln 2 = 5,54)$

b_B : Basislinienbreite

FWHM : „Full Width at Half Maximum“ Fwhm

n: Peakkapazität; Gibt an, wie viele Peaks innerhalb eines Intervalls zwischen t₀ und dem k-Wert eines bestimmten Peaks theoretisch mit einer Auflösung von R=1 voneinander getrennt werden können.

$n=1+ \frac{\sqrt{N}}{4}\cdot\ln(1+k_{max})$

• H bezeichnet die Trennstufenhöhe (oder theoretische Bodenhöhe) eines theoretischen Bodens (HETP) und ist das Verhältnis zwischen Säulenlänge und Bodenzahl:

$H=\frac{L}{N}$

Praktische Werte liegen im Bereich von 0,1 bis 0,5 mm.

Trennstufenhöhe H

Die Trennstufenhöhe einer chromatografischen Säule ist ein Maß für die Trennleistung der Säule. Als Trennstufe kann man sich den gedachten Abschnitt der Trennsäule, auf dem sich das chromatografische Gleichgewicht einmal einstellt, vorstellen. Je mehr solche Gleichgewichtseinstellungen „auf der Säule Platz haben“ umso geringer ist die Trennstufenhöhe und umso höher ist die Trennleistung der Säule. Zur Erlangung einer niedrigen Trennstufenhöhe sind unter analytischen Bedingungen folgende Voraussetzungen nötig:

1. Es wird eine rasche Gleichgewichtseinstellung der Adsorption oder Verteilung erwartet. Daher sollte der Teilchendurchmesser so klein wie möglich sein.
2. Konstante Temperatur in der gesamten Säule. Dazu kann ein Säulenthermostat benutzt werden.
3. Konstante Fließgeschwindigkeit: Hierfür wird eine Kolbenpumpe mit bis zu 400 bar verwendet.
4. Linearer Adsorptionsbereich: Die stationäre Phase sollte im Verlauf der Chromatografie nicht überladen werden.
5. Vernachlässigbare Diffusion wäre wünschenswert, ist experimentell aber leider nicht erreichbar. Es werden daher möglichst regelmäßige Packungen mit Teilchen von besonders kleinem Durchmesser verwendet.

Zur Ermittlung der Trennstufenhöhe in Abhängigkeit von der Fließgeschwindigkeit des Eluenten kann die sog. Van-Deemter-Gleichung für die HPLC herangezogen werden:

$H = A + {B \over u_x} + C \cdot u_x$

wobei:

• H die Trennstufenhöhe,
• u_x die lineare Fließgeschwindigkeit ist.
• A-Term berücksichtigt die Eddy-Diffusion die durch unterschiedliche Fließstrecken durch die Packung entsteht. Es gilt: $A = 2 \cdot p \cdot d$ wobei
  • p den Packungsfaktor,
  • d den Teilchendurchmesser bezeichnet.
• Der B-Term berücksichtigt die longitudinale Diffusion. Die longitudinale Diffusion ist die Diffusion der Analytenmoleküle in beide Richtungen der Trennstufe. Es gilt: $B = 2 \cdot D \cdot L$ wobei:
  • D die Diffusionskonstante in der mobilen Phase und
  • L der Labyrinthfaktor ist. Der Labyrinthfaktor berücksichtigt die Porenstruktur der stationären Phase.
• der C-Term berücksichtigt die Peakverbreiterung durch die langsame Gleichgewichtseinstellung zwischen der mobilen und der stationären Phase. Hierbei ist noch die Diffusionskonstante D_s entlang der Poren der stationären Phase zu beachten. Es gilt $C = {{t_s \over t_m} \over (1+{t_s \over t_m})^2} \cdot {d^2 \over D_s}$

Peaksymmetrie

Theoretisch sollte jede Substanz eine Chromatografiesäule als scharf eluierende Linie verlassen. Aus verschiedenen Gründen besitzen chromatografische Peaks jedoch immer eine gewisse Breite. Im Idealfall weisen sie dabei die Form einer Gauß’schen Glockenkurve auf. In der Praxis kommt es aber häufig vor, dass die Peaks von dieser Idealform abweichen und mehr oder weniger asymmetrisch erscheinen. Eine Asymmetrie, bei der der Frontanstieg des Peaks steiler ist als der Peakabfall, bezeichnet man als „Tailing“, während der Effekt, dass der Anstieg weniger steil ist als der Abfall als „Fronting“ bezeichnet wird. Der Tailingfaktor, der ein Maß für die Peaksymmetrie darstellt, wird bestimmt, in dem man vom Peakmaximum das Lot zur Basislinie fällt, und in einer bestimmten Höhe, meist in 10 % der Peakhöhe, die Abstände zur Peakfront (a) und zum Peakende (b) ermittelt. Anschließend wird der Quotient der beiden Werte gebildet, wobei unterschiedliche Berechnungsformeln (z. B. nach IUPAC oder nach USP) in Gebrauch sind:

Ein idealer „Gauß-Peak“ erreicht dabei den Wert 1, Werte über 1 bedeuten „Tailing“, Werte unter 1 dagegen „Fronting“.

Praktisches Experiment

Chromatografie kann man mit handelsüblichen Mitteln zu Hause durchführen. Man benötigt:

• eine Filtertüte, möglichst weiß oder schwarz
• einige Buntstifte von wasservermalbarer Sorte und auf jeden Fall Eddingstifte, die nicht wasserlöslich sind.

Auf den unteren Rand des Kaffeefilters trägt man Farbe auf und stellt das Papier in eine Schale mit Wasser, sodass sich das Papier mit Wasser vollsaugt.

Da die Farbe der Buntstifte wasserlöslich ist, transportiert das Wasser nun die Farbe nach oben.

Ein z. B. roter Buntstift ist im Grunde nicht rot, sondern besteht aus einem Gemisch unterschiedlicher Farben, die zusammen rot wirken. In dem Experiment gehen die unterschiedlichen Farbenpigmente nun mit dem Papier eine unterschiedlich starke Wechselwirkung ein und werden dadurch vom Wasser mehr oder weniger schnell transportiert.

Daher kann man bald mehrere, verschiedenfarbige Flecken erkennen, die Buntstiftfarben werden chromatografisch getrennt.

Um die Abhängigkeit der Trennung vom Lösungsmittel zu testen, kann man dieses Experiment mit demselben Stift noch einmal mit Wodka, Reinigungsbenzin oder Brennspiritus durchführen und die unterschiedlichen Resultate beobachten. (Das sollte man jedoch nur in gut gelüfteten Räumen tun, da die Dämpfe vom Reinigungsbenzin giftig sind.)

Siehe auch

• Analytik
• Anionenaustauschchromatografie
• Papierchromatografie
• Dünnschichtchromatografie
• Flüssigchromatografie
• Frontalchromatographie
• Gaschromatografie
• Gel-Permeations-Chromatografie
• Multidimensionale Chromatografie

Weblinks

• Analytische Chemie – Chromatographie auf chemgapedia.de
• Einführung in die Chromatografie (englisch)
• Seite zu Chromatografie am NTK Landau
• Umfangreiche Übersicht von Herstellern für LC-Systeme
• Gute Beispielanwendungen zur Chromatographie in der Proteinanalytik