- Eiweißgerinnung
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Denaturierung bezeichnet eine strukturelle Veränderung von Biomolekülen wie zum Beispiel Proteinen (Eiweiße) oder der Desoxyribonukleinsäure (DNA), die in den meisten Fällen mit einem Verlust der biologischen Funktion dieser Moleküle verbunden ist.
Inhaltsverzeichnis
Prinzip der Denaturierung
Die durch äußere Einflüsse hervorgerufene Veränderung der Proteinstruktur, insbesondere der Sekundär- und Tertiärstruktur eines Proteins (und damit eventuell auch seiner Quartärstruktur) erfolgt, ohne dass sich die Reihenfolge der Aminosäuren (Primärstruktur) ändert. Der Vorgang kann reversibel (umkehrbar) oder irreversibel (unumkehrbar) sein. Reversible Veränderungen der Molekülstruktur liegen beispielsweise bei der Hitzedenaturierung von DNA vor, wenn diese bei einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erhitzt und wieder abgekühlt wird. Bei der irreversiblen Veränderung der Molekülstruktur kann der ursprüngliche räumliche Aufbau des Moleküls nicht wiederhergestellt werden. Dies passiert zum Beispiel beim Kochen des Frühstückeis, was ja nicht wieder weicher gekocht werden kann, wenn es erstmal ein „hartes Ei“ geworden ist. Die Denaturierung von Proteinen führt in der Regel dazu, dass das Molekül inaktiviert wird, das heißt, dass das Molekül seine biologische Funktion nicht mehr oder nur in geringerem Maße ausführen kann.
Konformationsänderungen an Proteinen erfolgen auch durch Prionen, jedoch spricht man dabei nicht von Denaturierung.
Ursachen der Proteindenaturierung können z.B. chemische Substanzen wie Säuren, Basen, Salze, Detergentien, extreme Temperaturen sowie UV-Strahlung sein. Proteinstrukturen können auch durch Schwermetalle zerstört werden, da die Ionen Komplexstrukturen mit den Aminosäureresten bilden und so die signifikante Struktur des Proteins verändern. In der Molekularbiologie werden gezielt verschiedene denaturierende Agentien eingesetzt, um Proteine in Proben auszufällen. So werden Säuren (wie Perchlorsäure oder Trichloressigsäure), wasserlösliche organische Lösungsmittel (wie Ethanol oder Aceton), Schwermetalle oder Hitzedenaturierung und Ultrafiltration verwendet. Zur Denaturierung von Proteinen kommt es auch bei der Koagulation mit Hochfrequenzstrom in der Medizin. Durch ein Erhöhen der Gewebetemperatur auf 50 bis 80 °C kommt es zu einer Gerinnung der Gewebeproteine und der Bindegewebsfasern. Dieses Verfahren wird in der Regel zur Blutstillung mit bipolaren oder monopolaren Greifern oder mit Platten-, Kugel- oder Walzenelektroden angewendet.
Allen Denaturierungsvorgängen ist gemeinsam, dass kovalente Bindungen (außer den Disulfid-Brücken in Proteinen) nicht gespalten werden. Die Kettenstruktur und damit die Abfolge der Bausteine (Primärstruktur) bleibt also erhalten. Durch Energiezufuhr werden aber die einzelnen Bausteine, d.h. Nukleotide und Aminosäuren, oder auch die ganze Molekülkette, so sehr ins Schwingen gebracht, dass Bindungen und wirkende Kräfte (Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Effekte, Disulfidbrücken) zwischen verschiedenen Bereichen der Molekülkette gespalten bzw. aufgehoben werden.
Von der Denaturierung der Proteine zu unterscheiden ist die Proteinspaltung, bei der die Makromoleküle in ihre Bausteine aufgespalten werden.
Hitzedenaturierung
Die Wärme- oder Hitzedenaturierung ist eine Art der Denaturierung, bei der eine Veränderung der Molekülstruktur durch (zumeist) hohe Temperaturen herbeigeführt wird. Durch die Hitzeeinwirkung können sich neue/andere Bindungen zwischen Kettenabschnitten oder auch zu benachbarten Molekülen ausbilden, wodurch häufig eine Veränderung der (Sekundärstruktur und) Tertiärstruktur bei Enzymen und anderen funktionellen Proteinen eintritt. Dies kann oft einen Verlust der biologischen Aktivität sowie eine Abnahme der Löslichkeit zur Folge haben. Letzteres macht sich dann als „Ausflocken“ oder „Gerinnung“ bemerkbar. Eine Hitzedenaturierung kann (wie andere Denaturierungen) reversibel (umkehrbar) sein, wenn die strukturellen Veränderungen noch nicht zu tiefgreifend sind, häufig ist sie aber irreversibel (unumkehrbar). Die Temperatur, bei der die Denaturierung der Proteine beginnt, ist je nach Aufbau und Organismus recht unterschiedlich. Die Enzyme hyper-thermophiler Archaeen müssen Temperaturen weit über 80 °C aushalten.
Ein Beispiel aus dem Alltag: Bei sehr hohem Fieber über 40°C können Proteine, vorwiegend im Hirn und Blut, denaturieren (daher Kopf raus im Heißbad). Solange das Fieber nicht allzu lange anhält, ist dieser Vorgang reversibel, über 42°C dauerhaft (irreversibel). Nach etwa sechs Stunden kann es allerdings Probleme bei der Wiederherstellung der nativen Struktur der Proteine geben, auch wenn 42°C nicht erreicht wurden. Wenn die Enzyme aus dem Grundstoffwechsel nicht mehr „arbeiten“, ist die Versorgung des Körpers mit Energie nicht mehr in geeignetem Maße möglich (zum Beispiel, wenn Enzyme der Atmungskette nicht mehr funktionieren und die Zellen nicht mehr mit der lebenswichtigen Energie versorgt werden). Der Tod tritt ein. Bestimmte Moleküle wie Chaperone und Hitzeschockproteine helfen beim Erhalt und der Wiederherstellung der Struktur der Proteine.
Fieber dient der Inaktivierung von Krankheitserregern, die dieser Temperatur nicht gewachsen sind. Dabei ist aber zu beachten, dass manche Organismen („... thermophilus“) z.B. aus heißen Quellen selbst kochendes Wasser gut vertragen.
Durch Autoklavieren werden Keime auf Gegenständen mittels Denaturieren lebenswichtiger Biopolymere inaktiviert. Beim Autoklavieren muss eine Temperatur deutlich über 100°C bei erhöhtem Druck über eine vorgegebene Zeit eingehalten werden, um sicher zu sterilisieren.
Nucleinsäuren denaturieren innerhalb eines recht engen Temperaturintervalls, auch „Schmelzpunkt“ genannt, der meist oberhalb von 80 °C liegt. Die Denaturierung ist reversibel. Durch ein Abkühlen der Nucleinsäuren lagern sich die Einzelstränge wieder zusammen. Diesen Vorgang macht man sich in der Molekularbiologie bei der Durchführung von PCR zunutze, um bestimmte Gene aus einem Organismus in vitro zu vervielfältigen: extrahierte DNA wird bei hohen Temperaturen in einem Reaktionsgefäß geschmolzen (Denaturierung). Anschließend wird die Temperatur wieder bis zu einer bestimmten Temperatur abgesenkt. Diese sogenannte Annealing-Temperatur hängt von den Primern ab und liegt normalerweise 2–3 °C unter ihrem Schmelzpunkt (50 bis 65 °C). Die in der Lösung enthaltenen Primertemplates lagern sich an die DNA-Einzelstränge an (Annealing oder auch Primerhybridisierung genannt). Nun werden mit Hilfe einer Taq-Polymerase die Stränge wieder vervollständigt (Elongation). Der Zyklus von Denaturierung, Annealing und Elongation beginnt von vorn. Es werden etwa 25 bis 50 Zyklen durchgeführt. Man macht sich also die reversible Denaturierung der DNA bis zu 50 Mal zunutze, um ein gesuchtes Gen eines Organismus zu vervielfältigen.
Hitzedenaturierung kann auch zu Änderungen kovalenter Bindungen und damit zu Kettenbrüchen (Depolymerisation) führen.
Denaturierung durch energiereiche Strahlung
Wie die Übertragung von Energie in Form Infrarotlicht kann auch jede andere Energieübertragung, z.B. in Form von UV-Licht, Mikrowellen oder anderer Strahlungsquellen, denaturierend wirken. Allerdings können energiereiche Strahlen wie UV-Licht, Gamma- und Röntgenstrahlen insbesondere auch mit kovalenten Bindungen besonders von Nukleinsäuren interagieren und zu Kettenbrüchen (Depolymerisationen) führen. Umgekehrt kann energiereiche Strahlung auch zusätzliche kovalente Bindungen (z.B. Dimerisierung in Nukleinsäuren) bewirken.
Säure- und Lauge-Denaturierung
Die Säuredenaturierung führt zu Ladungsverschiebungen zwischen den Molekülen und letzten Endes zum selben Ergebnis wie die Hitzedenaturierung.
Die Säure gibt Protonen (H+) ab und verursacht damit die Ladungsänderung in der Proteinstruktur, sodass die Wasserstoffbrückenbindungen (zer)stört werden.
Zusätzlich gibt die Säure Protonen (H+) an die Carboxylatgruppe (COO-) ab, sodass eine Carboxylgruppe COOH entsteht. Dies führt dazu, dass keine ionischen Wechselwirkungen in dem Protein mehr möglich ist. Entsprechendes können Laugen bewirken, auch sie ändern die Quantität der Ionen (den pH-Wert).Säuren wie Laugen können auch zu Änderungen kovalenter Bindungen führen (Hydrolyse).
Denaturierung durch Ethanol
Entsprechend der Säuredenaturierung kann Ethanol die in Biopolymeren zur Aufrechterhaltung der Struktur erforderlichen Wasserstoffbrücken stören, indem er als polares Lösungsmittel interferiert. 50-70% Ethanol denaturiert die meisten Proteine und Nukleinsäuren. Da durch Zerstörung der Raumstruktur Membranproteine ihre Funktion verlieren und die betreffenden Zellen luftballonartig platzen, kann so mit höherprozentigem Ethanol desinfiziert werden: Bakterien- und Pilzzellen werden über die Denaturierung ihrer Membranproteinen irreversibel inaktiviert, entsprechend werden behüllte Viren ihrer proteinhaltigen Hülle beraubt.
Denaturierung durch reines Wasser
Proteine liegen in ihrer natürlichen Umgebung in Gegenwart von anderen Proteinen, gelösten Salzen oder anderen biologischen Metaboliten vor, die auf mehr oder weniger komplexe Weise die natürliche Proteinstruktur stabilisieren. Entfernt man Salze und andere kleinere Moleküle durch Dialyse einer Proteinlösung gegen bidestilliertes Wasser - vorzugsweise in der Kälte-, kann man oft selektive (und reversible) Denaturierung vor allem von großen Proteinen erreichen, die unter diesen Bedingungen ausgefällt werden (präzipitieren).
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